雙亞芐基哌啶與蛋白酶體抑制劑下調(diào)ADRM1表達(dá)誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡

鄭曉輝 王玉孝 隋華秀

[摘要]目的 探討雙亞芐基哌啶（RA190）與蛋白酶體抑制劑（MG132）對(duì)HL60細(xì)胞的作用及機(jī)制。方法 以終濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.5、1.6、3.2 μmol/L RA190或MG132處理HL60細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，不加藥HL60細(xì)胞為對(duì)照組，無(wú)細(xì)胞完全培養(yǎng)基為空白組，各組培養(yǎng)24 h，CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。以1 μmol/L RA190或MG132處理24 h HL60細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，雙染法流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡率;Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)黏附調(diào)節(jié)分子1（ADRM1）表達(dá)水平。結(jié)果 HL60細(xì)胞傳代培養(yǎng)1年后，MG132實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率高于1年前，也高于RA190實(shí)驗(yàn)組;RA190與MG132實(shí)驗(yàn)組的凋亡率顯著高于對(duì)照組;RA190實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率顯著高于MG132實(shí)驗(yàn)組;此時(shí)，RA190與MG132實(shí)驗(yàn)組內(nèi)ADRM1蛋白表達(dá)灰度值比低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 傳代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)可提高HL60細(xì)胞對(duì)MG132的耐藥性;RA190與MG132均可下調(diào)HL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)其凋亡;RA190的誘凋亡效果優(yōu)于MG132。

[關(guān)鍵詞]雙亞芐基哌啶;HL60細(xì)胞;蛋白酶體抑制劑;黏附調(diào)節(jié)分子1;存活率;凋亡

[中圖分類號(hào)] R329.2+5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）8（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Bis-Benzylpiperidine （RA190） and proteasome inhibitor （MG132） on HL60 cells. Methods HL60 cells were treated with the final concentration of 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.8， 1.5， 1.6 and 3.2. μmol/L RA190 or MG132 as the experimental group， and HL60 cells control group without medication and blank group with acellular complete medium were designed， each group was cultured for 24 hours. CCK8 assay was used to detect the cell survival rate. Apoptosis rate of HL60 cells treated with 1 μmol/L RA190 or MG132 for 24 hours as experimental group was detected by flow cytometry with double staining. Western blot was used to detect the expression of intracellular adhesion regulating molecule 1 （ADRM1）. Results One year after subculture of HL60 cells， the cell survival rate of MG132 experimental group was higher than that of one year ago， and also higher than that of RA190 experimental group; the apoptotic rate of RA190 and MG132 experimental group was significantly higher than that of control group， and the early apoptotic rate of RA190 experimental group was significantly higher than that of MG132 experimental group， at this time， the gray value ratio of ADRM1 protein expression in RA190 and MG132 experimental group was lower than that of control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Prolonged subculture time can increase the drug resistance of HL60 cells to MG132; both RA190 and MG132 can down-regulate ADRM1 protein level in HL60 cells， induce cell apoptosis. RA190 is superior to MG132 in inducing apoptosis effect.

[Key words] Bis-Benzylidine Piperidon; HL60 cell; Proteasome inhibitor; Adhesion regulating molecule 1; Survival rate; Apoptosis

惡性腫瘤自主生長(zhǎng)、逃避凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的特征是其內(nèi)部基因突變或表達(dá)異常所致。靶向異?；蛑委熓钱?dāng)前研究熱點(diǎn)。ADRM1蛋白是26S蛋白酶體上的泛素受體，介導(dǎo)NF-κB、TGF-β1受體等底物蛋白降解，在肺癌、肝癌、急性白血病等多種癌細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá);其表達(dá)下調(diào)顯著促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[1-7]。因此，ADRM1可能成為腫瘤治療靶點(diǎn)。

傳統(tǒng)的蛋白酶體抑制劑（MG132）可抑制泛素蛋白酶體活性，抵消17β-雌激素對(duì)原代神經(jīng)元內(nèi)Cav1.2蛋白下調(diào)作用[8]，抑制病毒復(fù)制[9]，誘導(dǎo)Burkitt淋巴瘤、急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、肝癌等癌細(xì)胞凋亡[6，10-12]，協(xié)同促進(jìn)全反式維甲酸誘導(dǎo)GTF2I-RARA融合基因陽(yáng)性的HL60細(xì)胞分化[13];還可通過(guò)Smad信號(hào)通路抑制TGF-β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制腎間質(zhì)纖維化[14]。近幾年發(fā)現(xiàn)的靶向ADRM1藥物雙亞芐基哌啶（RA190）可快速觸發(fā)多泛素蛋白累積，誘導(dǎo)對(duì)硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡，抑制卵巢癌、肝癌等多種癌細(xì)胞增殖[3，15-20]。那么，RA190與MG132在AML中作用效果如何？本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察髓系白血病細(xì)胞株HL60在RA190或MG132作用下的存活率和凋亡率，比較兩藥對(duì)HL60細(xì)胞的作用及與ADRM1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，為臨床采用靶向ADRM1治療AML方案奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人急性粒細(xì)胞白血病部分分化型細(xì)胞HL60為本實(shí)驗(yàn)室保存;MG132（Sigma），RA190、CCK8（MCE），Western blot抗體（CST公司），RPMI 1640（Corning），胎牛血清（Gemini）;酶標(biāo)儀、高電流電泳儀PowerPac HC（Bio-rad公司）;流式細(xì)胞儀EPICSXL （貝克曼庫(kù)爾特公司）;垂直電泳槽VE-180（上海天能科技有限公司）;快速Western Blot儀器MA01821（Millipore）。

1.2 方法

1.2.1 CCK8法? 設(shè)3復(fù)孔，在96孔板中接種100 μl細(xì)胞懸液，終濃度1×105/ml，設(shè)不同濃度RA190與MG132藥物實(shí)驗(yàn)組（終濃度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.5、1.6、3.2 μmol/L）、對(duì)照組（不加藥）和空白組（只含完全培養(yǎng)基），于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入10 μl CCK-8溶液，孵育3 h;酶標(biāo)儀測(cè)定450/630 nm處吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）A450/630值/（對(duì)照組-空白組）A450/630值×100%。

1.2.2 Annexin V FLUOS Staining Kit 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡? 設(shè)2復(fù)孔，在6孔板中接種4 ml細(xì)胞懸液，終濃度1×106/ml，分別以1 μmol/L MG132和 RA190 作用 HL60細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，預(yù)冷的PBS洗2次，之后按Annexin V FLUOS Staining Kit試劑盒說(shuō)明書操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)? 設(shè)2復(fù)孔，細(xì)胞接種與分組加藥操作同“1.2.2”。收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液（含1 mmol/L PMSF、1 mmol/L正釩酸鈉、10 mg/L抑肽酶）提取總蛋白，取40 μg總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。操作步驟詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（4版）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度RA190、MG132作用下HL60細(xì)胞存活率的比較

2.1.1傳代1年前后HL60細(xì)胞在MG132作用下存活率的比較? 設(shè)終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.5、1.6、3.2 μmol/L MG132實(shí)驗(yàn)組和不加藥對(duì)照組，傳代培養(yǎng)1年前后HL60細(xì)胞存活率見(jiàn)表1。MG132終濃度為0.1 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率無(wú)顯著變化;MG132終濃度為0.2～1.5 μmol/L時(shí)，同一MG132終濃度下，1年后HL60細(xì)胞存活率均高于1年前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MG132對(duì)1年后HL60細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）約0.88 μmol/L高于1年前的約0.42 μmol/L。

2.1.2 HL60細(xì)胞在RA190與MG132作用下存活率的比較? 設(shè)終濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L RA190與MG132實(shí)驗(yàn)組和不加藥對(duì)照組。在0.2～1.6 μmol/L，RA190實(shí)驗(yàn)組各濃度下存活率均低于MG132實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;RA190對(duì)HL60細(xì)胞的IC50約0.68 μmol/L低于MG132的約0.88 μmol/L。

3討論

從遺傳上看，癌都是由一個(gè)失去了增殖控制的細(xì)胞發(fā)展而來(lái);人體每天都有幾十億個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分裂，任何一個(gè)細(xì)胞都有可能由遺傳成分的改變而癌變。細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化需要發(fā)生多個(gè)遺傳改變，因此腫瘤發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)式的過(guò)程，涉及多級(jí)反應(yīng)和突變的積累。癌細(xì)胞不斷積累突變，賦予突變細(xì)胞新的特性，使癌細(xì)胞更具危險(xiǎn)性，即惡性度提高，從而越來(lái)越不受體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制的控制，并逐漸轉(zhuǎn)移侵襲正常組織。本實(shí)驗(yàn)中，MG132對(duì)1年后HL60細(xì)胞的IC50高于1年前，可能是由于HL60細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間的分裂過(guò)程中積累突變，使細(xì)胞惡性度提高，提高了對(duì)MG132的耐藥性，這提示抗腫瘤藥治療效果的臨床前實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇對(duì)應(yīng)階段患者的腫瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

RA190與MG132實(shí)驗(yàn)組的早期與晚期凋亡率均高于對(duì)照組，RA190實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率高于MG132實(shí)驗(yàn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這提示RA190與MG132均可促進(jìn)HL60細(xì)胞凋亡，前者的作用效果優(yōu)于后者。此時(shí)，兩實(shí)驗(yàn)組ADRM1蛋白表達(dá)灰度值比低于對(duì)照組，說(shuō)明RA190與MG132通過(guò)降低HL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，這提示靶向ADRM1蛋白表達(dá)可應(yīng)用于臨床AML的治療。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于只用了1株細(xì)胞且未做藥物對(duì)ADRM1過(guò)表達(dá)或沉默白血病細(xì)胞的作用效果比較，結(jié)果較缺乏說(shuō)服力。

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（收稿日期：2019-04-24? 本文編輯：許俊琴）