硅鈣微弧氧化涂層鈦基體成骨細(xì)胞生物相容性的研究

鄒智群 楊曉宇

[摘要]目的 探討不同電壓微弧氧化（MAO）處理后含鈣硅涂層的鈦基體材料成骨細(xì)胞的生物相容性。方法 純鈦材料進(jìn)行MAO后（MAO-200 V，MAO-300 V，MAO-400 V）處理制成不同的含鈣硅涂層鈦材料作為實驗組（實驗組B、實驗組C、實驗組D），純鈦作為對照組，每組各15個試件。采用MC3-T3細(xì)胞系在實驗組和對照組材料上進(jìn)行培養(yǎng)，用掃描電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，觀察細(xì)胞在實驗組和對照組材料表面的附著和增值情況。結(jié)果 實驗組在應(yīng)用不同電壓處理前后電解液中的鈣、磷濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在早期（0.5、1 h）時，實驗組B、實驗組C、實驗組D的細(xì)胞黏附率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;2 h后實驗組B、實驗組C、實驗組D的細(xì)胞黏附率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），各實驗組的細(xì)胞黏附率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組細(xì)胞材料表面的OD值均增加（P<0.05）;培養(yǎng)1、4 d時，對照組與實驗組的OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至7、10 d時，實驗組的OD值均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 在不同電壓MAO處理后含鈣硅涂層的鈦材料表面成骨細(xì)胞早期附著、形態(tài)變化和增殖優(yōu)于純鈦，具有良好的生物相容性。

[關(guān)鍵詞]鈦;微弧氧化;成骨細(xì)胞;表面處理;生物相容性

[中圖分類號] R318.08? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）8（b）-0008-05

[Abstract] Objective To investigate the biocompatibility of osteoblasts of titanium matrix coated with calcium and silicon after microarc oxidation （MAO） at different voltages. Methods After the MAO of pure titanium material （MAO-200 V， MAO-300 V， MAO-400 V） coated with different calcium-containing silicon titanium materials were prepared as the experimental group （experiment group B， experimental group C， experimental group D）， and the pure titanium was used as the control group， with 15 test pieces in each group. The MC3-T3 cell lines were cultured on the experimental group and the control group. The morphology of cells was observed by scanning electron microscopy， and the adhesion and value of cells on the surface of the experimental group and the control group were observed. Results There were no significant differences in the concentration of calcium and phosphorus in the electrolyte before and after application of different voltage treatments in the experimental group （P>0.05）. At the early stage （0.5， 1 h）， the cell adhesion rates of experimental group B， experimental group C and experimental group D were higher than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.01）. After 2 h， the cell adhesion rates of experimental group B， experimental group C and experimental group D were higher than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The cell adhesion rate of each experimental group was not statistically significant （P>0.05）. With the prolongation of culture time， the OD value of the cells in the experimental group increased （P<0.05）， and the OD values of the control group and the experimental group were not significantly different when cultured for 1 and 4 days （P>0.05）. At 7 and 10 days， the OD values of the experimental group were significantly higher than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Osteoblasts of titanium matrix coated with calcium and silicon after MAO at different voltages have better early attachment， morphological change and proliferation than pure titanium， and have good biocompatibility.

[Key words] Titanium; Microarc oxidation; Osteoblast; Surface treatment; Biocompatibility

國內(nèi)研究顯示，種植體表面進(jìn)行微弧氧化（MAO）是一種直接在鈦表面生長層進(jìn)行表面處理技術(shù)，是在鋁、鎂、鈦及其合金表面通過電解液依靠弧光放電產(chǎn)生的作用與相應(yīng)電參數(shù)的組合，制作出以鈦金屬氧化物為主要元素的陶瓷層[1-3]。王航等[4-7]研究成骨細(xì)胞作為錨和依賴性細(xì)胞能夠在種植體表面的進(jìn)行黏附及叢集是種植體獲得初期穩(wěn)定性的重要因素，婁琪等[8-10]研究細(xì)胞在材料表面的黏附與伸展受到材料表面性質(zhì)如表面形貌及表面化學(xué)等的影響。本研究采用MAO對鈦材料表面進(jìn)行改性，在電解液中不同電壓下加入鈣硅元素形成鈣硅涂層以增加鈦的抗腐蝕能力，對于涂層后鈦的生物相容性進(jìn)行實驗研究，以期新的涂層技術(shù)使鈦能早日成為新型的可降解的醫(yī)用植入材料應(yīng)用于臨床。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

1.1.1主要儀器

YZ-2500超凈工作臺;CO2培養(yǎng)箱;CKX41倒置顯微鏡;TD25-WS多管架自動平衡離心機;電子天平;37℃水浴箱;掃描電鏡;LSM 510 META共聚焦激光掃描生物顯微鏡;酶聯(lián)檢測儀;冰箱;加樣槍;燒杯;三蒸水等。

1.1.2主要試劑

α-MEM培養(yǎng)液;0.25%胰蛋白酶;胎牛血清;雙抗;磷酸鹽緩沖液;二甲基亞砜（DMSO）;CCK-8;堿性磷酸酶活性測定試劑盒;鬼筆環(huán)肽等。

1.1.3金屬材料

鈦片10 mm×10 mm，厚度1 mm的純鈦片，超聲波清洗機。

1.2方法

1.2.1實驗分組

將MAO的鈦材料按照不同電壓合成的方法分為實驗組B、實驗組C、實驗組D及對照組，每組各15個試件。實驗組B采用200 V電壓處理平板鈦，實驗組C采用300 V電壓處理平板鈦，實驗組D采用400 V電壓處理平板鈦，對照組為平板純鈦。

1.2.2實驗準(zhǔn)備

各實驗組全部用大量的去離子水進(jìn)行反復(fù)沖洗，之后經(jīng)丙酮、無水乙醇超聲蕩洗10 min后，去離子水再次反復(fù)沖洗，進(jìn)行烘干，濕熱法消毒。用掃描電鏡觀察制作的生物膜表面形態(tài)，用衍射圖譜（XRD）分析生物膜層的主要成分，用能譜（EDS）分析生物膜層中的鈣、硅元素的具體含量。

1.2.3實驗過程

1.2.3.1成骨細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)? 用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化5 min左右，觀察細(xì)胞的具體形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)圓形，且大部分細(xì)胞幾乎脫離培養(yǎng)瓶底時，加入培養(yǎng)液（15%胎牛血清，1 μl/ml青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行終止消化作用，用膠頭滴管吸收消化液進(jìn)人離心管中，2000 r/min的速率進(jìn)行離心，5 min后去除離心后的上清液，之后放入完全培養(yǎng)液，形成成骨細(xì)胞混懸液，加到3個容量為50 ml的培養(yǎng)瓶中。每個培養(yǎng)瓶中均放入3 ml完全培養(yǎng)液，在37℃的溫度下含有5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)。每天在倒置熒光顯微鏡下目測原代成骨細(xì)胞和傳代成骨細(xì)胞的生長狀態(tài)、增殖及形態(tài)特征，對生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行鏡下拍照。

1.2.3.2細(xì)胞黏附實驗? 將第四代細(xì)胞接種到三種材料的表面聯(lián)合培養(yǎng)所有實驗組的16個金屬件，將成骨細(xì)胞以105個/ml的濃度接種于金屬件表，置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔培養(yǎng)板內(nèi)均填入FBS的α-MEM培養(yǎng)液1.0 ml，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.5、1、2、4 h后，于各培養(yǎng)板取出其中4個金屬件，應(yīng)用PBS反復(fù)漂3次，吸凈PBS液體，其中隨機將其中1個金屬件進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，3個試件加入200 μl的培養(yǎng)液與20 μl的CCK-8共同培養(yǎng)4 h后，各孔吸取100 μl置于新的96孔板中，采用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm處測定吸光度（OD值）。

1.2.3.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察? 將試件冷PBS漂洗后，用1.5%戊二醛4℃固定1～2 h。PBS洗3次，10 min/次。再用多聚甲醛固定30 min，用PBS洗3次，10 min/次。乙醇溶液上行脫水（30%、50%、70%、90%、95%、100%）各濃度脫水2次，15 min/次。100%丙酮脫水3次，30 min/次。試件4℃丙酮保存。臨界點干燥、噴金、觀察與拍照。

1.2.3.4用CCK-8法檢測成骨細(xì)胞的增殖率? 所有實驗組15枚金屬件在24孔培養(yǎng)板內(nèi)放置，按照105個/ml的濃度把成骨細(xì)胞接種于金屬件表面，隔3 d換1次液，于1、4、7、10 d后用PBS重洗3遍后，（對照組無細(xì)胞）每孔加入含有FBS的α-MEM培養(yǎng)液200 μl，與CCK-8 20 μl共同置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，于各孔吸出100 μl，加入新的96孔板中，采用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm處測定吸光度。細(xì)胞增殖率=（ODn-ODo）/ODo，ODn：某檢測時間點的OD值，ODo：對照組的OD值。

1.2.3.5鈦片表面成骨細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)觀察? 按照40 000/孔的密度接種細(xì)胞，6 h拿出其中一組標(biāo)本用PBS反復(fù)沖洗3次，之后應(yīng)用2%多聚甲醛進(jìn)行固定，20 min后再用0.2% TritonX100在常規(guī)室溫下進(jìn)行成骨細(xì)胞處理，15 min后用含1%牛血清白蛋白的PBS反復(fù)沖洗標(biāo)本，20 min后再用PBS反復(fù)沖洗3次。最后將標(biāo)本放到其他的24孔板中，室溫下將300 μl FITC標(biāo)記的phalloidin放入24孔板中，60 min后用蒸餾水反復(fù)沖洗、甘油封片，激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）觀察標(biāo)本。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布者轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 MAO改性后的形貌結(jié)構(gòu)特征

不同電壓下材料表面出現(xiàn)無數(shù)細(xì)小、涌動放電的弧光，處理后的材料表面是薄薄的白堊色陶瓷膜。掃描電鏡下材料形成的生物膜呈均勻多孔的粗糙面，微孔直徑為0.5～2 μm。隨電壓不斷升高，鏡下可見微孔的直徑不斷增大（圖1）。實驗組材料的EDS分析結(jié)果顯示，生物膜由鈦（Ti）、鈣（Ca）、硅（Si）、鈉（Na）四種基本元素組成。在應(yīng)用不同電壓處理前后電解液中的鈣、磷濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。XRD分析結(jié)果顯示，生成的生物薄膜結(jié)晶度高，其中以銳鈦礦相TiO2及少量金紅石相TiO2為主，還包含少量的非晶相組分（圖2，封四）。

2.2各組不同時間點附著情況及細(xì)胞形態(tài)的比較

在早期（0.5、1 h）時，實驗組B、實驗組C、實驗組D的細(xì)胞黏附率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;2 h后實驗組B、實驗組C、實驗組D的細(xì)胞黏附率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），各實驗組的細(xì)胞黏附率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組內(nèi)，隨著時間的延長，細(xì)胞黏附率逐漸遞增（P<0.05）（表1）。

掃描電鏡下觀察，對照組純鈦表面成骨細(xì)胞呈球形，細(xì)胞機械貼附在純鈦表面，這種黏附不穩(wěn)定，易脫落（圖3A）;實驗組（不同電壓處理）的材料表面，細(xì)胞呈扁平狀，多數(shù)進(jìn)行不規(guī)則并有較多突起的伸展，細(xì)胞已形成生物學(xué)黏附，此黏附比較牢固（圖3B～D）。

2.3各組成骨細(xì)胞不同時間點增殖情況的比較

隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組細(xì)胞材料表面的OD值均增加（P<0.05）;培養(yǎng)1、4 d時，對照組與實驗組的OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至7、10 d時，實驗組的OD值均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;各實驗組的OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2、圖4，封四）。

MC3T3細(xì)胞接種于含純鈦和納米化鈦板的一次性培養(yǎng)皿中培養(yǎng)6 h，激光共聚焦顯微鏡檢測，在對照組中，可見肌動蛋白纖維多在細(xì)胞膜周圍分布，呈車輪樣排列，細(xì)胞多數(shù)成圓形、橢圓形，鋪展面積小（圖5A，封四）。在MAO不同電壓處理表面，肌動蛋白纖維出現(xiàn)不規(guī)則伸展，部分細(xì)胞出現(xiàn)可以辨別的張力纖維肌絲，細(xì)胞伸展較為充分（圖5B～D，封四）。

3討論

劉繼光等[11-14]研究表明，在鈦金屬表面通過等離子技術(shù)原位生成一層致密的具有較好生物相容性的陶瓷氧化膜。制作過程中鈦金屬試樣浸在溶液里能觀察到在其金屬表面會有來回游動的火花微弧，擊穿的過程總是發(fā)生在陶瓷氧化膜比較薄弱的部位衍生出均勻的生物膜，生物膜與金屬體結(jié)合力比較強。本研究中通過在含有鈣、硅離子的電解液中MAO工藝致使鈦表面氧化膜在高電壓下產(chǎn)生介電擊穿作用，出現(xiàn)放電火花，是一種將鈣、硅離子加入到鈦金屬生物膜表面的行之有效的方法。周睿等[15-17]報道了通過應(yīng)用不同MAO工藝可以調(diào)整和控制純鈦表面氧化層的粗糙度、形態(tài)、孔徑厚度、離子成分、生成物結(jié)構(gòu)等參數(shù)。成骨細(xì)胞在種植體表面黏附，其附著對種植體成功獲得初期穩(wěn)定性有重要意義。本研究采用體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的成活率比較高，成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性較明顯。因此，成骨細(xì)胞是目前比較理想的細(xì)胞之一。本研究采用的是MC3T3細(xì)胞株，可以保證實驗成果的可靠性。

田宏等[17-18]研究，在體外對成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，光滑鈦金屬表面成骨細(xì)胞的形態(tài)和黏附能力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在光滑鈦金屬表面成骨細(xì)胞梭形，與材料表面平行排列，電鏡觀察到在粗糙的鈦片表面細(xì)胞礦化活動比較活躍。本研究結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞分別接種于不同電壓下形成的鈦金屬氧化膜表面，觀察實驗組與對照組材料表面細(xì)胞的變化，不同電壓處理后的實驗組成骨細(xì)胞呈多邊形，肌絲伸展良好，在材料表面有較好的黏附性，細(xì)胞伸展到材料表面的孔洞內(nèi)，這可能是由于MAO處理使鈦合金的表面粗糙度和表面能均顯著增加，從而影響了其表面特性，所以促進(jìn)了細(xì)胞在其表面生長，與對照組比較，其胞體較大，細(xì)胞突起更豐富。何夢喬等[18-19]研究顯示，骨量不足時，表面粗糙的種植體比表面光滑的種植體成骨細(xì)胞有更高的黏附性，是影響骨結(jié)合強度的關(guān)鍵之一。本研究通過改變電壓和改變電解液的配方，加入鈣、硅離子，對微弧氧化工藝的進(jìn)行了一定改進(jìn)，在純鈦金屬表面上成功制備出孔徑均勻的多孔隙陶瓷薄層生物膜，通過一系列反應(yīng)將直接鈣、硅元素直接滲入到生物膜中，增加了材料表層的生物相容性。成骨細(xì)胞在制作出來的生物膜涂層表面可以黏附、增殖，具有良好的伸展性。

綜上所述，在純鈦金屬表面上通過改變電壓和改變電解液的配方，制作出鈦載鈣硅MAO涂層，觀察成骨細(xì)胞在不同處理的涂層表面附著、增殖，結(jié)果顯示，采用MAO技術(shù)可以在純鈦表面形成含有鈣硅復(fù)合氧化陶瓷涂層能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的附著、增殖和伸展，其在活體組織中的研究有待進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]翁升欣，趙旭，關(guān)岳鋒，等.口腔種植體抗菌涂層材料研究進(jìn)展[J].中國實用口腔科雜志，2016，9（1）：49-53.

[2]田宗蕊.人工合成抗菌肽在口腔疾病治療中的研究進(jìn)展[J].醫(yī)療裝備，2016，29（7）：199-200.

[3]李德超，魯萌萌，李慕勤，等.抗菌肽生物涂層對成骨細(xì)胞活性和牙齦卟啉單胞菌抗菌性影響[J].中國體視學(xué)與圖像分析，2016，21（4）：402-409.

[4]王航.鈦表面功能化膜層的構(gòu)建及電化學(xué)沉積鈣磷涂層的研究[D].廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2015.

[5]劉繼光，范繼文，姚海濤，等.純鎂超聲微弧氧化-植酸-載鋅、銅復(fù)合膜層植入體動物植入研究[J].中國體視學(xué)與圖像分析，2017，22（2）：189-196.

[6]梅雙.純鈦種植體表面生物礦化構(gòu)建及對骨結(jié)合影響的研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2016.

[7]古麗巴努·依馬木，徐國強，迪麗努爾·阿吉，等.硅烷偶聯(lián)劑對純鈦表面改性及細(xì)胞相容性的影響[J].中國組織工程研究，2014，18（12）：1864-1869.

[8]婁琪，肖月，李慕勤，等.純鈦微弧氧化載杜仲提取物生物膜層生物相容性研究[J].微量元素與健康研究，2017，34（4）：6-9.

[9]劉辰.骨植人用新型可降解鎂合金材料設(shè)計及生物醫(yī)學(xué)功能究[D].南京：南京理工大學(xué)，2016.

[10]張杰，祝芳芳，遲艷俠，等.AZ91D鎂合金基鈣磷/殼聚糖/CN骨植入材料在m-SBF中腐蝕行為的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2016，39（2）：3-6.

[11]劉繼光，孫玉龍，李慕勤，等.純鎂微弧氧化-HF-硅溶膠復(fù)合處理涂層細(xì)胞相容性研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2015， 31（5）：429-432，436.

[12]張宇承.抗菌骨修復(fù)材料HAPw/n-ZnO的抗生物膜作用及抗菌機理研究[D].昆明：昆明醫(yī)科大學(xué)，2016.

[13]王湛，楊軍，李建軍.新型骨科植人物鎂合金材料抗菌性能的體外實驗研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，43（12）：1142-1144.

[14]許育東，陳云幫，石敏，等.金屬表面硅烷化處理應(yīng)用的研究[J].金屬功能材料，2011，18（5）：66-69.

[15]周睿.純鈦微弧氧化陶瓷涂層結(jié)構(gòu)調(diào)控及生物學(xué)性能[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2015.

[16]王善濤.體外實驗研究純鈦表面納米銀涂層對金黃色葡萄球菌的抗菌性能[D].濟南：山東大學(xué)，2014.

[17]田宏，丁勇，王亞明，等.鈦合金微弧氧化/有機硅轉(zhuǎn)化復(fù)合涂層的制備與高溫性能[J].材料熱處理學(xué)報，2016，27（6）：177-181.

[18]何夢喬，李慕勤，李德超.高溫與紫外線消毒對鈦復(fù)合涂層細(xì)胞相容性的影響[J].中國體視學(xué)與圖像分析，2015， 20（3）：274-281.

[19]林春麗，王旭，李世明，等.細(xì)胞增殖檢測（CCK-8檢測法）最佳實驗條件的確定[J].國外畜牧學(xué)（豬與禽），2017， 37（5）：88-90.

（收稿日期：2019-02-19? 本文編輯：任秀蘭）