氣調(diào)包裝對烤鴨腿貨架期及微生物多樣性的影響

趙嘉越，羅 欣,2，楊嘯吟，毛衍偉，梁榮蓉，董鵬程，朱立賢,*，張一敏,*，劉國星，高合江

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；3.北京市恒慧通肉類食品有限公司，北京 101302）

烤鴨作為我國傳統(tǒng)肉制品之一，歷史悠久且深受消費者喜愛，具有色澤誘人、香氣濃郁、皮脆肉嫩、肥而不膩的特點而享譽中外。但目前烤鴨大多通過簡單的托盤包裝或直接暴露于空氣中銷售，產(chǎn)品易受微生物污染，導(dǎo)致貨架期短且銷售半徑小[1]。部分企業(yè)通過二次殺菌結(jié)合真空包裝來延長烤鴨的貨架期，但二次殺菌會使烤鴨失去皮香脆的特點，烤鴨特有風(fēng)味及營養(yǎng)損失嚴(yán)重，真空包裝則易造成烤鴨汁液損失、脂肪溢出、產(chǎn)品變形等[2-3]。

無氧氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP）能抑制肉品的微生物生長和脂肪氧化酸敗，抑制風(fēng)味劣變，延長其貨架期[4]，使產(chǎn)品具有衛(wèi)生安全、良好外觀的優(yōu)點。其中，CO2和N2的混合氣體因能抑制大多數(shù)微生物生長而特別適合保存熟肉和腌制肉[5]。CO2是主要的抑菌物質(zhì)，它能延長微生物的遲滯期并降低對數(shù)期的生長速率[6]。N2主要作為填充氣體使用，可防止CO2被產(chǎn)品吸收后造成的包裝塌陷并排除O2[7]。體積分?jǐn)?shù)5%～50%的CO2具有抑菌作用，而更高體積分?jǐn)?shù)的CO2抑菌效果不明顯[1,8]，一旦CO2體積分?jǐn)?shù)超過50%則會導(dǎo)致包裝出現(xiàn)明顯凹陷，對外觀造成不利影響[9-10]。對于易腐敗且無呼吸作用的肉制品而言，理想狀態(tài)應(yīng)是排除O2，適當(dāng)提高CO2或N2體積分?jǐn)?shù)[11-12]。

肉品腐敗是由優(yōu)勢菌群不可控生長和其一系列代謝活動所致[13]。微生物生長特別是具有高腐敗潛力的細(xì)菌生長會使肉品腐敗并產(chǎn)生變色、不愉快氣味、黏液等有害影響[14]。不同貯藏條件如包裝內(nèi)氣體組分、溫度和抗菌物質(zhì)的應(yīng)用等會影響微生物菌群演替及其致腐能力[15-16]。氣調(diào)包裝下，肉品中的微生物群落為適應(yīng)包裝內(nèi)氣體環(huán)境的改變，通常會向不同方向進(jìn)行生態(tài)演替，導(dǎo)致貯藏過程中菌群的多樣性不斷發(fā)生變化，進(jìn)而影響肉制品的微生物貨架期[16-18]。然而，對于氣調(diào)包裝熟肉制品微生物多樣性的研究目前還多選用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，但這種方法評估熟肉制品中細(xì)菌群落的能力有限。近幾年，高通量測序正逐漸被應(yīng)用于對微生物多樣性的分析，它既能完整覆蓋微生物群落，還可根據(jù)數(shù)百萬序列對每個樣本中單個操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）的數(shù)量進(jìn)行定量估計，被證明是能更精確鑒定微生物種類的有效手段[19]。目前已有研究將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于生鮮肉和熟肉制品，Wang Taojun[18]、Yang Xiaoyin[16]等分別研究了不同氣調(diào)包裝羊肉和牛肉的菌群變化及差異，Chen Xue等[20]研究了冰溫下牛肉貯藏過程中的菌群結(jié)構(gòu)變化，Ge Qingfeng等[21]對不同工廠間金華火腿的菌群結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行了分析。對于熟肉制品，Xiao Xiang[22]、謝萍[23]和Li Xinfu[24]等分別對真空包裝下肴肉、散裝醬鹵鴨翅和煙熏培根貯藏過程中的菌群結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，但鮮有高通量測序技術(shù)應(yīng)用于氣調(diào)包裝烤鴨類產(chǎn)品微生物多樣性分析，明確不同包裝烤鴨的微生物多樣性及主要微生物有助于對該類產(chǎn)品品質(zhì)控制的研究。

本實驗以烤鴨腿為研究對象，以托盤包裝作為對照，研究了體積分?jǐn)?shù)100% N2、體積分?jǐn)?shù)50% CO2+50%N2氣調(diào)包裝的烤鴨腿在0～4 ℃下貯藏期間微生物、品質(zhì)及感官指標(biāo)的變化規(guī)律，并采用高通量測序技術(shù)研究3 種包裝烤鴨腿貯藏過程中微生物群落演替規(guī)律，探究氣調(diào)包裝對烤鴨腿貨架期的影響及不同包裝方式對烤鴨腿菌群結(jié)構(gòu)的影響，為揭示烤鴨的微生物致腐機理、氣調(diào)包裝延長烤鴨貨架期等問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烤鴨腿產(chǎn)品取自北京市恒慧通肉類食品有限公司。

TQBC-0775托盤包裝盒（23 ℃、相對濕度（relative humidity，RH）0%下，透氧率為10 cm3/（m2·24 h）；38 ℃、RH 90%水蒸氣透過率為15 g/（m2·24 h））、Lid 1050/550密封阻隔膜（23 ℃、RH 0%下，透氧率為25 cm3/（m2·24 h），4 ℃、RH 100%下水蒸氣透過率為10 g/（m2·24 h）） 希悅爾包裝上海有限公司。

平板計數(shù)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)股份有限公司；BagPage?拍打袋法國Interscience公司；PicoGreen dsDNA定量檢測試劑盒美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DT-6D氣調(diào)保鮮包裝機 中國大江機械設(shè)備有限公司；CheckPoint氣體成分分析儀 丹麥PBI-Dansensor A/S公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；T18勻漿機 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；NanoDrop 1000分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與實驗設(shè)計

烤鴨加工工藝流程：生鴨前處理→生鴨上線→過熱水（2～3 min）→瀝水（2 min）→掛糖衣（1～2 min）→熱風(fēng)吹干（40 ℃、≥10 min）→烘烤（240 ℃、50 min）→室溫冷卻（≥30 min）→熟鴨下線→卸腿→真空包裝→殺菌（90 ℃、10 min）。

將上述殺菌結(jié)束后的烤鴨腿通過冷鏈物流車運回實驗室0～4 ℃冷庫，取真空包裝后的鴨腿，隨機分為3 組，每組52 只，分別進(jìn)行50% CO2+50% N2和100% N2的氣調(diào)包裝，并以普通托盤包裝為對照組。將包裝后的鴨腿置于0～4 ℃的黑暗環(huán)境中貯藏21 d，分別在第1、4、7、11、14、21天測定樣品的各項微生物指標(biāo)及脂肪氧化值，并在第1、7、14、21天進(jìn)行感官評定。每個時間點每個處理組重復(fù)6 次。

1.3.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物值的測定

硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測定》中的分光光度法測定。

1.3.3 感官評定

參照Santos[25]、宋蓮軍[26]等的方法稍作修改，由長期從事肉品研究的10 名人員組成評定小組，從滋味和總體可接受性兩個方面進(jìn)行評定。將烤鴨腿微波復(fù)熱，參數(shù)為高火（700 W）1 min、中高火（539 W）1 min、中火（385 W）1 min，品嘗復(fù)熱后的滋味和總體可接受性，具體標(biāo)準(zhǔn)見表1，當(dāng)任一項評分低于5 分時，則表示不能接受。

表1 烤鴨腿感官評定評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of roast duck legs

1.3.4 微生物的測定

于無菌環(huán)境下從每個樣品中隨機剪取25 g肉樣（包含表皮），剪碎放入含225 mL滅菌蛋白胨生理鹽水（含8.5 g/L NaCl和1 g/L蛋白胨）的拍打袋中，拍打袋在均質(zhì)拍打器中拍打2 min，按10 倍梯度稀釋到所需要的稀釋度。菌落總數(shù)的測定參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》；乳酸菌數(shù)的測定參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》；腸桿菌科數(shù)的測定參照GB 4789.41—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 腸桿菌科檢驗》。結(jié)果均以lg（CFU/g）表示。

1.3.5 DNA提取及高通量測序

DNA提取參考Yang Xiaoyin等[16]的方法，取相應(yīng)時間點的樣品，提取細(xì)菌總DNA（每個時間點、每個處理組3 個重復(fù)）后，通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并通過紫外分光光度計定量。采用由上海派森諾生物公司提供的方法，對細(xì)菌的16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR擴增參數(shù)為：98 ℃預(yù)變性2 min；進(jìn)入熱循環(huán)，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25～30 個循環(huán)；最后一個延伸為72 ℃、5 min。擴增產(chǎn)物通過Agencourt AMPure Beads純化，由PicoGreen dsDNA定量檢測試劑盒定量，再通過Illumina MiSeq平臺進(jìn)行DNA測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件一般線性模型中的單變量進(jìn)行雙因素方差分析，包裝方式和貯藏時間為固定因子，使用最小顯著性差異法對兩個因素的主效應(yīng)進(jìn)行多重比較，以F值測驗判斷兩因素交互作用是否顯著，P＜0.05為交互作用顯著。采用Sigma Plot 10.0軟件作圖。

測序數(shù)據(jù)分析參考Chen Xue等[20]的方法，通過定量微生物生態(tài)軟件（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）v1.8.0軟件篩選并通過Fast Length Adjustment of Short （FLASH）合并，從而得到高質(zhì)量Clean tags。嵌合體檢測后，用UCLUST對Effective tags按97%的序列相似度聚類成OTUs并篩選出代表序列，通過BLAST與SILVA數(shù)據(jù)庫中的模板序列對比，進(jìn)行進(jìn)一步分析。Alpha多樣性包括Shannon和Chao 1指數(shù)，均通過QIIME和R軟件（Version 3.2.0）分析。使用可視化工具GraPhlAn繪制分類等級樹以快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群。用R軟件進(jìn)行聚類分析繪制熱圖并對屬水平群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），以二維圖像描述樣本間的自然分布特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中TBARS值的影響

表2 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中TBARS值的影響Table 2 Effect of MAP on TBARS values of roast duck legs during storage

如表2所示，貯藏時間和包裝方式的交互作用顯著影響烤鴨腿的TBARS值（P＜0.05）。兩種氣調(diào)包裝烤鴨腿的TBARS值在21 d貯藏期內(nèi)變化平穩(wěn)，均始終維持在0.29～0.40 mg/kg內(nèi)，而托盤包裝烤鴨腿的TBARS值在貯藏期間顯著增加（P＜0.05），從初始值0.58 mg/kg增加到末期的1.53 mg/kg，并在第11天超過1 mg/kg，說明脂肪氧化程度逐步增大。從貯藏4 d起，托盤包裝烤鴨腿的TBARS值顯著高于氣調(diào)包裝（P＜0.05），但兩種氣調(diào)包裝烤鴨腿無顯著性差異（P＞0.05）。Guo Yuchen等[27]同樣發(fā)現(xiàn)與放置于空氣相比，氣調(diào)包裝顯著抑制了烤雞的脂肪氧化（P＜0.05），但100% N2包裝與含不同比例CO2的氣調(diào)包裝對烤雞TBARS值的影響無顯著差異（P＞0.05）。由于托盤包裝中的O2促進(jìn)了脂肪氧化，導(dǎo)致TBARS值不斷增加，而氣調(diào)包裝的殘氧含量極低。因此，O2是導(dǎo)致烤鴨腿脂肪氧化極為重要的因素，可進(jìn)一步影響口感、風(fēng)味等，甚至損害其營養(yǎng)價值[9,28-29]?？梢姛o氧氣調(diào)包裝有效抑制了烤鴨腿的脂質(zhì)氧化。

2.2 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中感官指標(biāo)的影響

感官評分是衡量肉制品品質(zhì)較為直接、快速的指標(biāo)，對消費者購買烤鴨起決定性作用。貯藏時間和包裝方式的交互作用對烤鴨腿品嘗時的滋味和總體可接受性影響顯著（P＜0.05）。由表3可知，3 種包裝烤鴨腿的滋味和總體可接受性的評分在貯藏期間顯著降低（P＜0.05），氣調(diào)包裝和托盤包裝烤鴨腿的兩項評分均分別在21 d和7 d降到5 分以下，貯藏7 d后，托盤包裝烤鴨腿的評分顯著低于氣調(diào)包裝（P＜0.05），可能由于托盤包裝烤鴨腿的脂肪氧化嚴(yán)重，產(chǎn)生了不愉快味道。但兩種氣調(diào)包裝烤鴨腿的評分無顯著性差異（P＞0.05）。在貯藏初期，產(chǎn)品沒有表現(xiàn)出腐臭、酸敗、發(fā)黏等腐敗特性。托盤包裝烤鴨腿在14 d時已表現(xiàn)出酸敗味，此時，氣調(diào)包裝下的烤鴨腿依然可以接受，而氣調(diào)包裝烤鴨腿在貯藏21 d時表現(xiàn)出輕微酸敗味。感官品評結(jié)果表明，氣調(diào)包裝烤鴨腿的感官貨架期接近21 d，托盤包裝烤鴨腿的感官貨架期接近7 d。因此相對于托盤包裝，氣調(diào)包裝更有利于烤鴨腿風(fēng)味的保持[30]。

表3 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中滋味和總體可接受性的影響Table 3 Effect of MAP on taste and overall acceptability of roast duck legs during storage

2.3 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中微生物指標(biāo)的影響

2.3.1 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中菌落總數(shù)的影響

表4 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中菌落總數(shù)的影響Table 4 Effect of MAP on total viable count of roast duck legs during storage

由表4可知，貯藏時間和包裝方式的交互作用對烤鴨腿菌落總數(shù)影響顯著（P＜0.05）。50% CO2+50% N2、100% N2和托盤包裝烤鴨腿的菌落總數(shù)初始值分別為2.64、2.54、2.52（lg（CFU/g）），且均隨貯藏時間延長而顯著增加（P＜0.05）。21 d內(nèi)100% N2包裝烤鴨腿的菌落總數(shù)增長速率最快，在第11天有4 個樣品（共6 個樣品）超過GB 2726—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》中規(guī)定的熟肉制品菌落總數(shù)的最高安全限量值5（lg（CFU/g））。50% CO2+50% N2和托盤包裝烤鴨腿菌落總數(shù)增長緩慢，在第21天各有2 個樣品超過5（lg（CFU/g））。因此50% CO2+50% N2包裝烤鴨腿的貨架期接近21 d，100% N2包裝烤鴨腿的貨架期接近11 d。貯藏前7 d，3 種包裝烤鴨腿的菌落總數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），但100% N2包裝烤鴨腿在11 d后的菌落總數(shù)顯著高于50% CO2+50% N2和托盤包裝組（P＜0.05），可見CO2明顯抑制了烤鴨腿菌落總數(shù)的增加，是因為CO2具有延長細(xì)菌生長遲滯期并降低對數(shù)生長期的作用[6]。梁榮蓉等[10]同樣發(fā)現(xiàn)相較于100% N2包裝，50% CO2+50% N2氣調(diào)包裝可極顯著延長黃燜雞的貨架期（P＜0.01）。

2.3.2 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中乳酸菌數(shù)的影響

表5 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中乳酸菌數(shù)的影響Table 5 Effect of MAP on lactic acid bacterial count of roast duck legs during storage

如表5所示，貯藏時間和包裝方式的交互作用對烤鴨腿乳酸菌數(shù)無顯著性影響（P＞0.05），而貯藏時間和包裝方式分別對烤鴨腿乳酸菌數(shù)影響顯著（P＜0.05）。就貯藏時間而言，乳酸菌數(shù)隨貯藏時間延長顯著增加（P＜0.05）。就包裝方式而言，100% N2包裝烤鴨腿的乳酸菌數(shù)顯著高于50% CO2+50% N2和托盤包裝（P＜0.05），可能由于乳酸菌是兼性厭氧菌且是無氧條件下的優(yōu)勢腐敗菌，可以看出CO2明顯抑制了烤鴨腿貯藏過程中乳酸菌生長。Zhai Yang等[9]同樣發(fā)現(xiàn)相較于100% N2包裝，30% CO2+70% N2氣調(diào)包裝鹽水鴨中乳酸菌數(shù)較低。Lerasle等[29]則發(fā)現(xiàn)50% CO2+50% N2氣調(diào)包裝與空氣放置的禽肉腸中乳酸菌數(shù)無明顯差異。

2.3.3 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中腸桿菌科數(shù)的影響

表6 不同氣調(diào)包裝對烤鴨腿貯藏過程中腸桿菌科數(shù)的影響Table 6 Effect of MAP on Enterobacteriacese count of roast duck legs during storage

由表6可知，貯藏時間和包裝方式的交互作用對烤鴨腿腸桿菌科數(shù)影響顯著（P＜0.05）。50% CO2+50% N2、100% N2和托盤包裝烤鴨腿的腸桿菌科數(shù)均隨貯藏時間延長而顯著增加（P＜0.05）。100% N2和托盤包裝烤鴨腿的腸桿菌科分別在貯藏11 d和14 d后顯著高于50% CO2+50% N2包裝組（P＜0.05），可以看出CO2對腸桿菌科的生長有一定的抑制作用。

盡管傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可以測定微生物數(shù)量，但它不能完全反映貯藏過程中微生物菌群變化，由于一些不可培養(yǎng)的微生物無法通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測[16]。因此，采用高通量測序技術(shù)進(jìn)一步探究烤鴨腿貯藏過程中的微生物多樣性。

2.4 高通量測序

2.4.1 不同包裝方式下烤鴨腿的微生物多樣性分析

通過剔除疑問序列，得到了每個樣本的序列標(biāo)簽數(shù)，其中50% CO2+50% N2、100% N2和托盤包裝烤鴨腿的平均有效序列標(biāo)簽數(shù)分別為48 709、48 902、48 702 個。如表7所示，3 種包裝烤鴨腿中所含細(xì)菌存在差異，表明不同包裝方式的烤鴨腿在貯藏期間具有各自平衡的微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性。Shannon指數(shù)和Chao 1指數(shù)均在前7 d增加，之后呈減小趨勢，表明烤鴨腿中菌群多樣性呈先升高后下降趨勢。覆蓋度在99%以上，表明烤鴨中主要的微生物被發(fā)現(xiàn)，測序數(shù)據(jù)可以反映樣品的多樣性。

表7 貯藏期間3 種包裝烤鴨腿的菌群豐度和多樣性Table 7 Species richness and diversity of roast duck legs during storage under 3 different packaging conditions

2.4.2 不同包裝方式下烤鴨腿的微生物群落結(jié)構(gòu)變化

圖1 貯藏期間3 種包裝烤鴨腿中微生物群落的相對豐度（屬水平）Fig. 1 Relative abundance of bacterial community in roast duck legs during storage under 3 different packaging conditions (at genus level)

圖1 顯示貯藏時間和包裝方式對烤鴨腿微生物菌群結(jié)構(gòu)變化影響較大。從屬水平分析，烤鴨腿中主要的微生物（相對豐度＞1%）有16 種。整體來看，貯藏初期泛菌屬（Pantoea）在3 種包裝烤鴨腿中占絕對優(yōu)勢，但從7 d起逐漸降低，這時不同貯藏時間和包裝方式間的烤鴨腿微生物群落開始出現(xiàn)差異。

由圖1A可知，對于50% CO2+50% N2包裝烤鴨腿而言，貯藏過程中Pantoea、假單胞菌屬（Pseudomonas）和類香味菌屬（Myroides）交替成為優(yōu)勢菌群，Myroides相對豐度在11 d時突然增加，并成為11 d和14 d的優(yōu)勢菌群（相對豐度分別為43.3%和32.6%），之后其相對豐度開始降低；Pseudomonas相對豐度從第7天（7.7%）開始增加，在第21天時占據(jù)絕對優(yōu)勢（34.9%）。Pseudomonas、Pantoea和不動桿菌屬（Acinetobacter）可能是導(dǎo)致50% CO2+50% N2包裝烤鴨腿最終腐敗的主要微生物（21 d時相對豐度大于10%）。

由圖1B可知，對于100% N2包裝烤鴨腿，貯藏過程中索絲菌屬（Brochothrix）、Pantoea、Pseudomonas和肉食桿菌屬（Carnobacterium）交替成為優(yōu)勢菌群，貯藏初期除Pantoea占絕對優(yōu)勢外，Carnobacterium相對豐度較高；Brochothrix從貯藏7 d開始增加，并在11～21 d占有絕對優(yōu)勢（分別為45.6%、53.5%和42.7%）；Pseudomonas和明串珠菌屬（Leuconostoc）也在7 d開始增加，但始終低于Brochothrix；Pseudomonas、Brochothrix（11～21 d相對豐度均大于10%）和Leuconostoc（第21天相對豐度大于10%）可能是導(dǎo)致100% N2包裝烤鴨腿最終腐敗的主要微生物。

由圖1C可知，對于托盤包裝烤鴨腿而言，貯藏過程中Pantoea、Pseudomonas和Myroides交替成為優(yōu)勢菌群。同50% CO2+50% N2包裝烤鴨腿相似，托盤包裝烤鴨腿中Myroides相對豐度也在11 d時突然增加，成為優(yōu)勢菌群（43.3%），之后其相對豐度開始降低；而Brochothrix在14 d時最具優(yōu)勢（24.9%），Pseudomonas相對豐度從第7天（18.0%）開始增加，在第21天時占據(jù)絕對優(yōu)勢（48.5%）。Pseudomonas和Brochothrix可能是導(dǎo)致托盤包裝烤鴨腿最終腐敗的主要微生物（21 d時相對豐度大于10%）。Pseudomonas的蛋白水解能力可使它們滲入肉中利用營養(yǎng)物質(zhì)等占據(jù)利于其生長的生態(tài)位，從而在貯藏后期更具優(yōu)勢[31]。Pseudomonas數(shù)量的突然增加也可能與包裝膜的透氣率有關(guān)，隨著透氣率增加，Pseudomonas的數(shù)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致Brochothrix的相對豐度在貯藏末期呈現(xiàn)下降趨勢，但其數(shù)量依然增加[5]。Wang Taojun等[18]也發(fā)現(xiàn)無氧氣調(diào)包裝羊肉中的Pseudomonas數(shù)量在貯藏后期大幅度增加。

貯藏中后期50% CO2+50% N2和托盤包裝烤鴨腿中Myroides和Acinetobacter的相對豐度大于100% N2包裝烤鴨腿，100% N2包裝烤鴨腿中Brochothrix和Leuconostoc的相對豐度較高，為優(yōu)勢菌群；因此100% N2包裝烤鴨腿的菌落總數(shù)在11 d后顯著高于50% CO2+50% N2和托盤包裝可能與Brochothrix和Leuconostoc相對豐度增加有關(guān)。

2.4.3 不同包裝方式下烤鴨腿的微生物群落結(jié)構(gòu)比較

圖2是對微生物群落構(gòu)建的等級樹，不同顏色表示不同的OTUs，節(jié)點大?。◤睦锏酵猓┍硎疚⑸铮◤慕绲綄伲┑呢S度分布。分類等級樹可以直觀反映3 種包裝烤鴨腿在整個貯藏期間的優(yōu)勢菌群。21 d貯藏期內(nèi)，3 種包裝烤鴨腿中相對豐度較高的門均為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。不同包裝烤鴨腿的菌群結(jié)構(gòu)在科和屬水平差異較大，在科水平上，50% CO2+50% N2包裝烤鴨腿中相對豐度較高的為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae）；李斯特氏菌科（Listeriaceae）、腸桿菌科、假單胞菌科、肉桿菌科（Carnobacteriaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）和明串珠菌科（Leuconostocaceae）在100% N2包裝烤鴨腿中相對豐度較高；托盤包裝烤鴨腿中腸桿菌科、假單胞菌科、莫拉氏菌科、黃桿菌科和李斯特氏菌科的相對豐度較高。

在屬水平上，Pantoea、Myroides、Pseudomonas和Acinetobacter在50% CO2+50% N2包裝烤鴨腿中的相對豐度較高；100% N2包裝烤鴨腿中Brochothrix、Pantoea、Pseudomonas、Carnobacterium和Leuconostoc的相對豐度較高；托盤包裝烤鴨腿中相對豐度較高的是Pantoea、Pseudomonas、Myroides和Acinetobacter?？梢?0% CO2+50% N2與托盤包裝烤鴨腿的菌群結(jié)構(gòu)較為相似；且3 種包裝烤鴨腿的貨架期不同是優(yōu)勢菌群不同導(dǎo)致。相較于100% N2包裝，CO2可能抑制了烤鴨腿貯藏過程中的Brochothrix、Carnobacterium和Leuconostoc等的繁殖，而導(dǎo)致含CO2包裝組的微生物數(shù)量更少，也延長了烤鴨腿的貨架期。熱殺索絲菌可能會產(chǎn)生乳酸、乙醇和少量短鏈脂肪酸，使肉品產(chǎn)生不愉快的異味，影響烤鴨質(zhì)量。乳酸菌能使肉品變酸、發(fā)黏、產(chǎn)氣或綠變，從而引起腐敗[32]。Soldatou等[33]發(fā)現(xiàn)30% CO2+70% N2和70% CO2+30% N2包裝相較于托盤包裝，均在貯藏后期顯著抑制了羊肉產(chǎn)品Souvlaki中熱殺索絲菌的生長；Sheridan等[34]也發(fā)現(xiàn)相較于80% O2+20% CO2和真空包裝，50%CO2+50% N2包裝顯著降低了羊肉中熱殺索絲菌的數(shù)量。

圖2 貯藏期間3 種包裝烤鴨腿微生物群落總體分類等級樹圖Fig. 2 Classification tree diagram of bacterial community in roast duck legs during storage under 3 different packaging conditions

為進(jìn)一步分析3 種包裝烤鴨腿貯藏過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化及差異，進(jìn)行了熱圖分析（圖3a）和PCA（圖3b）。熱圖分析將相對豐度大于1%的菌群進(jìn)行聚類，可以發(fā)現(xiàn)在21 d貯藏期內(nèi)，3 種包裝烤鴨腿的菌群在1 d和4 d時聚在一起，說明貯藏初期3 種包裝烤鴨腿的菌群結(jié)構(gòu)相似，并在7 d時開始出現(xiàn)差異，50% CO2+50% N2和托盤包裝烤鴨腿的菌群與100% N2包裝組分別在11～21 d聚在一起，說明它們在此期間分別表現(xiàn)出相似的菌群結(jié)構(gòu)。PCA展現(xiàn)了不同取樣時間點微生物組成的相似度，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率分別為48.45%和25.07%。貯藏初期所有點聚集在一起，說明微生物菌群結(jié)構(gòu)相似，從第7天起，3 種包裝烤鴨腿的菌群結(jié)構(gòu)與初始微生物不同，并逐漸分化，且3 種包裝方式下烤鴨腿的菌群也出現(xiàn)差異，結(jié)果與熱圖分析一致。

圖3 貯藏期間3 種包裝烤鴨腿微生物群落的熱圖（a）和PCA（b）結(jié)果Fig. 3 Heatmap (a) and principal component analysis (b) of bacterial community in roast duck legs during storage under 3 different packaging conditions

3 結(jié) 論

本實驗通過微生物、品質(zhì)和感官指標(biāo)研究了3 種包裝方式對烤鴨腿貨架期的影響。相比于100% N2包裝，50% CO2+50% N2包裝對烤鴨腿菌落總數(shù)、乳酸菌和腸桿菌科具有明顯的抑制效果，可使烤鴨腿貨架期接近21 d。與托盤包裝烤鴨腿相比，氣調(diào)包裝顯著降低了烤鴨腿的脂肪氧化速率，感官品質(zhì)更佳。綜合比較，優(yōu)選出更適合烤鴨腿貯藏的包裝方式為50% CO2+50% N2包裝。

本實驗的微生物多樣性結(jié)果發(fā)現(xiàn)貯藏時間和包裝方式對烤鴨腿貯藏期間的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯影響。3 種包裝烤鴨腿的初始菌群結(jié)構(gòu)相似，但從第7天起出現(xiàn)差異并隨貯藏時間出現(xiàn)變化。50% CO2+50% N2和托盤包裝烤鴨腿的菌群結(jié)構(gòu)較為相似，但與100% N2包裝差別較大，對于50% CO2+50% N2包裝烤鴨腿，泛菌屬、假單胞菌屬、類香味菌屬及不動桿菌屬交替成為優(yōu)勢菌群，對于托盤包裝烤鴨腿，假單胞菌屬、泛菌屬、類香味菌屬和索絲菌屬交替成為優(yōu)勢菌群，而100% N2包裝烤鴨腿中的優(yōu)勢菌群為索絲菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、肉食桿菌屬及明串珠菌屬。50% CO2+50% N2氣調(diào)包裝可能由于抑制了索絲菌屬、肉食桿菌屬及明串珠菌屬的生長而延長了烤鴨腿的貨架期。本研究有關(guān)微生物群落演替規(guī)律的結(jié)果有助于開發(fā)靶向抑菌物質(zhì)而進(jìn)一步延長烤鴨貨架期。