Bacillus pumilus HN-10抗菌肽P-1對粉紅單端孢的抑菌機理

郭 娟，贠建民*，鄧展瑞，艾對元，張紊瑋，趙風云

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是一種引起果蔬采后病害的致病微生物[1]，它不但會導致果蔬紅粉病，還會產(chǎn)生對人和動物有害的單端孢霉烯族毒素，造成食品安全問題，引起食品源頭的污染[2-4]。目前對紅粉病病害的控制方法以化學藥物控制為主，但化學藥物控制容易引起微生物抗藥性，且化學藥物對環(huán)境也存在危害或潛在危害[5]，因此，尋找化學藥物替代品也成為目前研究的一大熱點。

抗菌肽是一種具有生物活性的蛋白類物質，其對微生物的抑制具有廣譜性，對真菌、細菌甚至病毒都具有抑制作用[6]，且不易產(chǎn)生耐藥性，因此有望成為化學藥物替代品，應用潛力和價值巨大。我國對抗菌肽的研究起步較晚，而且抗菌肽生產(chǎn)成本較高，對其抑菌機理研究尚不夠深入，其在農(nóng)業(yè)生防方面應用較少[7]。目前主要從胞內(nèi)及胞外作用兩大方面研究抗菌肽的抑菌機理[8]；例如Li Lirong等發(fā)現(xiàn)了一種能夠抑制白色念珠菌的抗菌肽，其能夠導致細胞膜去極化，破壞細胞膜，然后進入細胞內(nèi)部，將細胞阻滯在S期，造成細胞死亡[6]；Han Jinzhi等研究了AMP-jsa9對白色念珠菌的抑菌機理，發(fā)現(xiàn)AMP-jsa9能夠破壞白色念珠菌的細胞壁和細胞膜，導致細胞膜通透性增加，跨膜運輸受到抑制，應激反應下降，影響菌體新陳代謝，從而抑制菌體的生長[9]。有些抗菌肽還能夠通過抑制酶活性來達到抑菌目的；兩棲動物抗菌肽Carein1.8能夠抑制大腸桿菌的ATP酶合成達到抑菌作用[10]；副干酪乳桿菌FX-6產(chǎn)生的抗菌肽F1能夠抑制金黃色葡萄球菌的β-半乳糖苷酶的表達，同時抑制核酸的合成，從幾個方面造成細菌的死亡[11]。

本實驗所用抗菌肽P-1是一種新型陽離子抗菌肽，由本研究組分離純化于短小芽孢桿菌HN-10（Bacillus pumilus HN-10），其氨基酸序列為GGSGGGSSGGSIGGR，分子質量為1 149.14 Da，對粉紅單端孢具有很強的抑菌活性，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為1 μg/mL，但其抑菌機理尚不明確[12-13]。本實驗以粉紅單端孢為靶標菌，研究抗菌肽P-1對其細胞膜通透性、蛋白合成和核酸合成3 個方面的影響，以期闡明抗菌肽P-1對粉紅單端孢的抑菌機理，為抗菌肽P-1的應用提供科學指導和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗菌肽P-1分離純化于短小芽孢桿菌HN-10。粉紅單端孢購于中國微生物菌株保藏中心，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上生長及保存。

真菌蛋白提取試劑盒 上海貝博生物有限公司；Ezup柱式真菌基因組提取試劑盒 上海生工生物工程有限公司；溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH生化培養(yǎng)箱、THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科技有限公司；GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)照明、小型垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；DDS-307A電導率儀上海儀電科學儀器股份有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀儀器有限公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo Scientific公司；RF-5301熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽P-1對粉紅單端孢細胞膜通透性的影響

1.3.1.1 大分子釋放量的測定

參照Paul等[14]的方法并稍作修改，將粉紅單端孢培養(yǎng)至對數(shù)期（24 h），用PDA液體培養(yǎng)基重懸后，在150 mL菌懸液中加入500 μL 0.9 mg/mL抗菌肽P-1，使其終質量濃度為3 MIC（處理組），對照組加入等體積的無菌蒸餾水，于28 ℃ 120 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取10 mL菌懸液，6 000 r/min離心10 min后棄沉淀，分別測定上清液在260 nm和280 nm波長處的吸光度，每組3 次重復，數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.1.2 電導率的測定

參照劉夢茵等[15]的方法，將培養(yǎng)至對數(shù)期的粉紅單端孢用新鮮PDA液體培養(yǎng)基重懸后，加入抗菌肽P-1使其質量濃度為MIC，對照組加入等體積的無菌蒸餾水；每隔2 h取培養(yǎng)液10 mL，6 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液用電導率儀進行測定，實驗重復3 次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.2 抗菌肽P-1對粉紅單端孢胞內(nèi)蛋白合成的影響

1.3.2.1 對胞內(nèi)蛋白含量的影響

參照郝剛等[16]的方法并稍作修改，將粉紅單端孢培養(yǎng)至對數(shù)期后，6 000 r/min離心10 min，收集菌體并用液體PDA培養(yǎng)基重懸為1×108CFU/mL菌懸液，在150 mL菌懸液中加入500 μL 0.9 mg/mL抗菌肽P-1，使其終質量濃度為3 MIC，對照組加入等體積無菌蒸餾水，于28 ℃培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)2、4、6、8、10、12 h的菌懸液10 mL離心，取菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次。將沉淀轉移至研缽，用液氮將菌體研磨為粉末后加入500 μL預冷的20%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）和400 μL純水，冰浴10 min后離心取沉淀。用10% TCA再次重懸取沉淀，將菌體轉移至無菌試管中，加入100 μL生理鹽水重懸，再加入5 mL考馬斯亮藍染色液，室溫放置30 min后在595 nm波長處測定吸光度，實驗設置3 個平行，取平均值。

1.3.2.2 SDS-PAGE分析胞內(nèi)蛋白

參考陳飛龍等[11]的方法并稍作修改，將培養(yǎng)至對數(shù)期的粉紅單端孢用新鮮PDA液體培養(yǎng)基重懸后，加入抗菌肽P-1使其質量濃度為MIC，對照組加入等體積的無菌蒸餾水，6 h后提取胞內(nèi)蛋白。粉紅單端孢胞內(nèi)蛋白的提取參照真菌蛋白提取試劑盒說明書的步驟進行，對提取的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。分離膠質量分數(shù)為12%，濃縮膠質量分數(shù)為4%；每16 μL蛋白溶液中加入4 μL蛋白上樣緩沖液（5×），沸水浴5 min，至蛋白充分變性后冷卻至室溫，吸取15 μL上樣，電壓80 V，至樣品到達分離膠邊緣時加壓至120 V，直至樣品移動至距膠底端1 cm結束，將膠板取下染色后置于凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.3.3 抗菌肽P-1對粉紅單端孢核酸的影響

1.3.3.1 凝膠阻滯作用分析

粉紅單端孢基因組用Ezup柱式真菌基因組提取試劑盒按照說明書操作步驟進行提取。凝膠阻滯作用的分析參照Miao Jianyin等[17]的方法并稍作修改，基因組質量濃度用微型分光光度計測定，使OD260nm/OD280nm≥1.9，然后進行質量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。取5 μL粉紅單端孢基因組，分別加入5 μL不同質量濃度（MIC、2 MIC、3 MIC、4 MIC、5 MIC）的抗菌肽P-1溶液，對照組加入5 μL無菌水，室溫放置30 min后加入2 μL上樣緩沖液，吸取10 μL上樣，電壓90 V，待樣品移動至距膠板1 cm左右時停止電泳，取下膠板置于凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.3.3.2 與EB競爭性結合DNA分析

參照陳旋等[18]的方法并進行一定修改，用蒸餾水將粉紅單端孢DNA稀釋為50 μg/mL，每1 mL DNA溶液加入15 μL 100 μg/mL EB溶液。反應液混勻后于28 ℃避光孵育10 min。加入1 mL不同質量濃度（MIC、2 MIC、3 MIC、4 MIC）的抗菌肽P-1溶液，對照組加入等體積的無菌蒸餾水。反應液混勻后置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃避光孵育30 min。用熒光分光光度計掃描反應液在550～750 nm波長范圍的熒光強度（激發(fā)波長535 nm、發(fā)射波長550 nm）。

1.3.3.3 對粉紅單端孢體內(nèi)DNA和RNA合成的影響

參照Li Lirong等[19]的方法并稍作修改，收集對數(shù)期粉紅單端孢細胞，用PBS清洗2 遍后重懸為1.0×106CFU/mL的菌懸液。加入抗菌肽P-1溶液使其終質量濃度為MIC，混勻后于28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣9.85 mL，加入150 μL DAPI染色液（終質量濃度15 μg/mL），避光振蕩10 min后用熒光分光光度計分別測定真菌DNA熒光強度（激發(fā)波長364 nm、發(fā)射波長460 nm）和RNA熒光強度（激發(fā)波長400 nm、發(fā)射波長460 nm）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2007軟件進行平均值及標準差計算，所有數(shù)據(jù)均為3 次重復所得，用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗；采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽P-1對粉紅單端孢細胞膜通透性的影響

2.1.1 大分子釋放量分析

圖1 抗菌肽P-1對粉紅單端孢的大分子釋放量影響Fig. 1 Effect of antimicrobial peptide P-1 on macromolecular release from T. roseum

如圖1所示，處理組粉紅單端孢的蛋白和核酸釋放量都明顯高于對照組。其中，處理組粉紅單端孢上清液的蛋白含量在0 h時較對照組高，但二者差異不顯著（P＞0.05），這可能是抗菌肽P-1的存在所致。隨著處理時間的延長，尤其在4 h之后，二者差距逐漸增大，處理組蛋白的釋放量遠高于對照組（圖1A）。處理組核酸釋放量也較對照組出現(xiàn)明顯的差異（圖1B），在4 h后上清液中的核酸含量急劇上升，并且與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。因此可以推測，抗菌肽P-1能夠導致粉紅單端孢的細胞膜損傷，使大分子物質外泄。但關于膜損傷的原因是由抗菌肽P-1直接導致還是由抗菌肽P-1通過其他方式殺死細菌后膜自然裂解造成，還需進一步探討。

2.1.2 電導率分析

圖2 抗菌肽P-1對粉紅單端孢電導率的影響Fig. 2 Effect of antimicrobial peptide P-1 on electrical conductivity of T. roseum

如圖2所示，經(jīng)過抗菌肽處理的粉紅單端孢上清液的電導率明顯高于對照組，并且在2 h時就已有顯著差異（P＜0.05），因此可以推斷抗菌肽P-1首先導致了粉紅單端孢胞內(nèi)電解質釋放，再隨著處理時間的延長引起大分子物質的釋放。

2.2 抗菌肽P-1對粉紅單端孢胞內(nèi)蛋白的影響

2.2.1 胞內(nèi)蛋白相對含量分析

圖3 抗菌肽P-1對粉紅單端孢胞內(nèi)蛋白相對含量的影響Fig. 3 Effect of antimicrobial peptide P-1 on intracellular protein content of T. roseum

從圖3可以看出，未加抗菌肽的對照組粉紅單端孢菌胞內(nèi)蛋白相對含量呈現(xiàn)穩(wěn)定的增長趨勢，而添加了抗菌肽P-1的粉紅單端孢胞內(nèi)蛋白相對含量在前4 h內(nèi)呈現(xiàn)增長趨勢，這可能是由于此時抗菌肽P-1進入細胞內(nèi)部，導致膜受損但尚未破裂，胞內(nèi)蛋白相對含量暫時積累所致；但是從4 h開始，處理組的胞內(nèi)蛋白相對含量急劇降低。這一方面可能是由于膜損傷導致蛋白外流；另一方面可能是由于菌體的蛋白合成受到了抑制。

2.2.2 胞內(nèi)蛋白的SDS-PAGE分析

如圖4所示，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)對照組的胞內(nèi)蛋白條帶完整、清晰，而處理組的胞內(nèi)蛋白出現(xiàn)缺失，并且缺失的部分為分子質量在43.0～97.4 kDa之間的蛋白。因此可以判斷，抗菌肽P-1抑制了粉紅單端孢的胞內(nèi)蛋白合成，使菌體生長受阻，進而導致菌體死亡。

圖4 SDS-PAGE分析抗菌肽P-1對粉紅單端孢胞內(nèi)蛋白的影響Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the effect of antimicrobial peptide P-1 on intracellular proteins of T. roseum

2.3 抗菌肽P-1對粉紅單端孢核酸的影響

2.3.1 凝膠阻滯作用分析

圖5 不同質量濃度抗菌肽P-1對粉紅單端孢的DNA凝膠阻滯作用Fig. 5 DNA gel retardation of T. roseum did not occur in the presence of antimicrobial peptide P-1 at different concentrations

從圖5可以看出，不同質量濃度抗菌肽P-1對粉紅單端孢DNA都沒有明顯的阻滯作用，但對照組和處理組DNA條帶的灰度出現(xiàn)明顯差異。對照組的粉紅單端孢DNA條帶清晰，而處理組的DNA條帶明顯變淡，并且這種作用在MIC時就已經(jīng)出現(xiàn)。這可能是由于抗菌肽P-1與粉紅單端孢DNA存在某種相互作用。實驗結果說明抗菌肽P-1雖對粉紅單端孢DNA沒有凝膠阻滯作用，但其也對DNA造成一定的影響，進而會影響到蛋白的表達。

2.3.2 抗菌肽P-1與EB競爭性結合DNA分析

圖6 抗菌肽P-1與EB競爭性結合粉紅單端孢DNAFig. 6 Competitive binding of antimicrobial peptide P-1 with EB to DNA of T. roseum

EB是一種可以和DNA結合的熒光染料，其單獨存在時熒光強度很弱，當其與DNA鑲嵌結合時熒光強度增強[19]；當有抗菌肽和DNA結合時，與DNA結合的EB會被競爭下來，導致熒光強度降低。圖6結果顯示，未加抗菌肽的粉紅單端孢DNA的熒光強度明顯高于處理組，并且熒光強度隨著抗菌肽質量濃度的增加而下降，說明抗菌肽P-1能夠和EB競爭性結合粉紅單端孢DNA，使粉紅單端孢的基因功能受到影響，從而抑制粉紅單端孢的生長。

2.3.3 抗菌肽P-1對粉紅單端孢體內(nèi)DNA和RNA合成的影響

圖7 抗菌肽P-1對粉紅單端孢胞內(nèi)DNA（A）和RNA（B）相對含量的影響Fig. 7 Effect of antimicrobial peptide P-1 on DNA (A) and RNA (B)contents of T. roseum

從圖7中可以觀察出，粉紅單端孢體內(nèi)DNA和RNA相對含量都是對照組明顯高于處理組，隨著時間延長，差異越來越明顯。經(jīng)抗菌肽P-1處理10 h后，與對照組相比，處理組DNA相對含量降低46%，RNA相對含量降低43%。由于DNA與RNA相對含量下降幅度接近，因此推測抗菌肽P-1可能只影響DNA的合成，由于DNA的減少，RNA相對含量才降低；但也可能是抗菌肽P-1對DNA和RNA都有抑制作用，這還需進一步探討?？偟貋碚f，抗菌肽P-1能夠抑制粉紅單端孢核酸的合成。

3 討 論

抗菌肽種類繁多、來源廣泛、毒性低且不易產(chǎn)生耐藥性，但其抑菌機理還不夠明確[20]。目前對抗菌肽抑菌機理的研究主要集中在其對細胞壁、細胞膜的作用機理以及對蛋白和核酸合成的影響方面，但仍未形成統(tǒng)一的結論，僅在作用靶點是細胞膜這方面有較多的研究。申玲[21]發(fā)現(xiàn)抗菌肽MAP28可以破壞白色念珠菌的細胞膜，使之形成孔洞，導致細胞內(nèi)容物外流，從而發(fā)揮抑菌作用。這是由于抗菌肽具有陽離子性，它能夠和細胞膜靜電結合而破壞膜結構，造成微生物的死亡。陳剛等[22]研究了由蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)狀抗菌肽APS對多種真菌的抑菌機理，通過構建脂質體模型，發(fā)現(xiàn)它破壞了膜完整性，在膜上形成電流通道，使膜出現(xiàn)孔洞，因而造成內(nèi)容物外泄而致使細胞死亡。

抗菌肽最先接觸到的是菌體細胞壁，細胞壁能維持菌體形狀，是菌體的第1道屏障，細胞壁一旦受到破壞，菌體也就受到了抑制，有些抗菌肽就是通過這種機制來發(fā)揮抑菌作用的[23]。當抗菌肽透過細胞壁這道屏障后接觸到細胞膜，氨基酸殘基能夠在靜電作用下與磷脂雙分子層結合，使得抗菌肽的疏水端插入膜上的疏水區(qū)而改變膜的結構，形成離子孔道，從而造成內(nèi)容物外泄，導致細胞受損，達到抑菌目的[24]。還有的抗菌肽能夠抑制菌體菌絲的萌發(fā)而造成菌體死亡。彭兵等[25]研究了枯草芽孢桿菌分泌的抗真菌肽FV對玉米小班病菌的抑菌機理，發(fā)現(xiàn)它抑制了菌體的孢子萌發(fā)，使菌絲變形，菌體表面變粗糙并出現(xiàn)褶皺，從而抑制了菌體的生長。

壁膜作用機制是抗菌肽最基礎的抑菌機理，其還可侵入細胞內(nèi)部發(fā)揮抑菌作用，關于抗菌肽對核酸作用機制的研究也較多。Sharma等發(fā)現(xiàn)人中性粒細胞肽HNP-1對結核分枝桿菌的抑菌作用除了破壞細胞膜外，還可以抑制DNA的生物合成，其能夠和DNA結合，將DNA作為其二級靶點來發(fā)揮作用[26]。

基于以上研究，本實驗通過測定菌懸液的電導率和大分子釋放量來確定細胞膜通透性的變化，在抗菌肽P-1處理粉紅單端孢2 h后電解質已經(jīng)開始釋放，蛋白和核酸外泄，證明P-1破壞了菌體細胞膜的結構，導致膜破裂，電解質物質和大分子物質外流，這可能是抗菌肽P-1對粉紅單端孢的抑菌機制之一。本研究進一步通過測定經(jīng)抗菌肽P-1作用后粉紅單端孢菌體胞內(nèi)蛋白的含量以分析抗菌肽P-1是否抑制了蛋白的合成。結果表明，在抗菌肽P-1處理4 h之后，菌體內(nèi)蛋白含量明顯下降，到6 h時差異顯著，因此選擇作用6 h后的菌體進行蛋白的提取，并進行SDS-PAGE分析，結果顯示粉紅單端孢在被抗菌肽P-1處理后部分蛋白條帶出現(xiàn)缺失，說明蛋白的合成受到了抑制。

本研究從凝膠阻滯作用、競爭性結合及核酸相對含量變化3 個方面闡述抗菌肽P-1對粉紅單端孢核酸的抑菌機理。結果表明，抗菌肽P-1雖未對粉紅單端孢DNA有明顯的凝膠阻滯作用，但能夠影響粉紅單端孢的體外DNA，造成DNA活性降低甚至降解DNA，使DNA在瓊脂糖凝膠上的條帶模糊；競爭性實驗說明抗菌肽P-1和EB競爭性結合DNA，但熒光強度下降較緩慢，這可能是由于抗菌肽P-1只是部分和EB競爭性結合粉紅單端孢DNA來發(fā)揮抑菌作用。綜上所述，抗菌肽P-1對粉紅單端孢的抑菌機理應該是多方面的，其對核酸的影響也只是其中之一。

目前已報道的抗菌肽大多是抗細菌肽，抗真菌肽還較少，對于抗細菌肽抑菌機理的研究也較抗真菌肽更為全面。由于不同細菌和真菌的細胞壁膜組成和結構存在差異，抗菌肽對真菌和細菌的抑菌作用機理也不可能完全相同[27]，因而研究抗真菌肽的抑菌機理更顯迫切。

4 結 論

本研究從Bacillus pumilus HN-10抗菌肽P-1對粉紅單端孢的壁膜通透性、蛋白合成及對核酸合成的影響3 個方面著手，研究了其抑菌機理。結果表明，抗菌肽P-1增加了粉紅單端孢的細胞膜通透性，可引起細胞壁膜的損傷及胞內(nèi)電解質和大分子物質的釋放；抗菌肽P-1抑制了粉紅單端孢的蛋白合成，尤其對分子質量在43.0～97.4 kDa之間的蛋白抑制作用明顯；而且抗菌肽P-1對粉紅單端孢DNA存在一定的影響，可以和EB競爭性結合DNA，抑制了粉紅單端孢的DNA和RNA合成?；诒狙芯拷Y果，可以得出抗菌肽P-1對粉紅單端孢的抑菌作用是影響其壁膜通透性、抑制蛋白和核酸的合成共同作用的結果。