強化交聯(lián)促進(jìn)透明質(zhì)酸凝膠的抗酶解能力

陸柳伸，鄭夢玲，郝夢瑤，王 武，辛 瑜

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）又稱玻璃酸、玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺以β-1，4和β-1，3糖苷鍵交替連接而成的線性高分子粘多糖[1]，通常以鈉鹽形式廣泛存在于動物組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，如皮膚、眼睛玻璃體、滑液和血液等[2]。其相對分子量一般在104～107之間。1934年Meyer和 Palmer[3]最先在從牛眼玻璃體中分離得到HA，由于HA特殊的理化性質(zhì)[4-5]，廣泛應(yīng)用于臨床、診斷、食品和化妝品行業(yè)中[6-9]。目前，HA主要利用微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[10-11]。

HA是細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)的主要成分，在維持細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)完整以及細(xì)胞內(nèi)外的環(huán)境平衡中起到重要作用，并且對細(xì)胞的生理功能有重大影響。HA在水溶液中與水分子結(jié)合形成氫鍵，因此具有良好的保水性，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[12]，HA分子可以保留其自身質(zhì)量的500～1 000倍的水，被譽為“天然保濕因子”。HA在水溶液中呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使其擁有特殊的流變學(xué)性質(zhì)即粘彈性。HA具有保濕護(hù)膚、抗衰老的功能，還有營養(yǎng)皮膚、潤滑性和增稠等作用，因此，富含透明質(zhì)酸的化妝品目前在國際上被譽為“仿生化妝品”。注射用透明質(zhì)酸凝膠已經(jīng)廣泛用于整形行業(yè)，如Restylane、YVOIRE、潤百顏、海薇等國內(nèi)外品牌。

人體中HA含量減少會使皮膚變得粗糙并產(chǎn)生皺紋，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、動脈硬化和腦萎縮等疾病，也會產(chǎn)生早老癥[13-18]。為了補充人體內(nèi)HA含量，可以通過口服透明質(zhì)酸來補充，其效果明顯，已在歐美、日本等發(fā)達(dá)國家應(yīng)用于保健食品中。美國透明質(zhì)酸保健食品在近幾年有許多品牌上市，如Natural Max公司生產(chǎn)的Beauty Fast膠囊，Source Naturals公司生產(chǎn)的含HA的膠丸和片劑等。我國臺灣和大陸也有產(chǎn)品陸續(xù)上市，如口服美容膠原透明質(zhì)酸、瑞爾水緣膠囊等。

由于透明質(zhì)酸凝膠在人體內(nèi)會被自身透明質(zhì)酸酶降解，從而限制了其應(yīng)用[19-21]。為了增強凝膠的機械強度以及在人體內(nèi)的滯留時間，目前常用BDDE以及DVS等交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)[22-24]。為了進(jìn)一步強化透明質(zhì)酸凝膠的穩(wěn)定性，作者擬采用初次交聯(lián)-強化交聯(lián)偶聯(lián)的制備模式，見圖1。在透明質(zhì)酸凝膠成型后進(jìn)一步加固凝膠顆粒的結(jié)構(gòu)，以此來提高透明質(zhì)酸凝膠的抗酶解能力。

圖1 初次交聯(lián)-強化交聯(lián)偶聯(lián)的模式Fig.1 Schematic of the primary and enhanced crosslinking of HA

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

透明質(zhì)酸（相對分子質(zhì)量1.7×106）：購自華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司；潤百顏、艾麗薇、海薇、瑞蘭：福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司；1，4-丁二醇縮水甘油醚（BDDE）、透明質(zhì)酸酶、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和葡萄糖醛酸：Sigma公司；遺傳毒性Ames試劑盒：匯智泰康生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、硫酸、氯化鈉、氫氧化鈉和硼砂等：由江南大學(xué)試劑科提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 透明質(zhì)酸凝膠的制備及初次交聯(lián)條件的篩選HA交聯(lián)采用的工藝流程見圖2。HA交聯(lián)反應(yīng)與NaOH的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及HA與BDDE的摩爾比有關(guān)。通過設(shè)計一個四因素四水平的正交試驗來確定最佳交聯(lián)條件，其因素水平表見表1。

圖2 HA交聯(lián)的工藝流程Fig.2 Process of crosslinking of HA

表1 HA初次交聯(lián)的因素水平表Table 1 Factor level table for primary crosslinking of HA

1.2.2 透明質(zhì)酸鈉含量的測定透明質(zhì)酸鈉（SH）是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖組成的非均一的物質(zhì)，其中含有多種不同相對分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸鈉分子，因此不能用均一物質(zhì)的測定方法來測量透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度。采用改良的咔唑法[25-26]來測定透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度，透明質(zhì)酸鈉分子在酸性條件下被水解成 D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖，其中D-葡萄糖醛酸能與咔唑發(fā)生顯色反應(yīng)，在530 nm波長處有最大吸收，且吸光值與D-葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度成正比，以吸光值（A）對葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度（C）做線性回歸方程，得到回歸方程：A＝0.015 3C－0.007 2，R2＝0.998 6。 表明葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度在0～50 μg/mL范圍內(nèi)，A與C呈良好的線性關(guān)系。此方法通過回歸方程來確定葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度，進(jìn)而計算出透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度。

式中，Ci為葡萄糖醛酸的質(zhì)量濃度（μg/mL）；401.3為透明質(zhì)酸鈉單體相對分子質(zhì)量；194.1為葡萄糖醛酸相對分子質(zhì)量；200為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 透明質(zhì)酸凝膠強化交聯(lián)為了提高交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的理化性質(zhì)，將初次交聯(lián)所得的凝膠進(jìn)行強化交聯(lián)，并通過NaOH的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及HA與BDDE的摩爾比這4個因素來設(shè)計一個四因素四水平的正交試驗，見表2，以此確定強化交聯(lián)的最佳條件。

表2 HA強化交聯(lián)的因素水平表Table 2 Factor level table for enhanced-crosslinking of HA

1.2.4 透明質(zhì)酸凝膠的降解率取0.5 g HA凝膠，加300 U/mL的透明質(zhì)酸酶溶液2 mL，37℃下反應(yīng)24、48、72 h，取 0.2 mL 加無水乙醇 4.8 mL，用濾器過濾得到1 mL溶液，加PBS至8 mL，作為甲液。另取HA凝膠0.5 g，加0.5 mol/L的硫酸溶液10 mL，沸水浴水解15 min，定容至100 mL，作為乙液[27]。分別取甲液和乙液各1 mL，用改良的咔唑法測定溶液中糖醛酸的質(zhì)量濃度。

1.2.5 透明質(zhì)酸凝膠交聯(lián)度的測定將最佳交聯(lián)條件得到的凝膠用酸水解后，所得的甘油的量用氣相色譜法檢測[28]，以此來確定交聯(lián)度。

樣品處理：取凝膠2.5 g，加2.5 mol/L HBr 5 mL，沸水浴水解50 min，用NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，冷凍干燥，加4 mL無水乙醇過濾，濾液用于氣相色譜測定。

色譜條件：色譜柱：HP-INNOWAX（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）；柱溫：100℃；20℃/min程序升溫至230 ℃，并保持 0.5 min；柱流速：8.0 mL/min；分流比：1∶1；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：270℃；載氣：氮氣；檢測器：氫火焰離子化檢測器。

1.2.6 透明質(zhì)酸凝膠的紅外光譜將初次交聯(lián)得到的凝膠和強化交聯(lián)得到的凝膠冷凍干燥，做FTIR，與未交聯(lián)的透明質(zhì)酸作對比。

1.2.7 透明質(zhì)酸凝膠的細(xì)胞毒性根據(jù)GB/T16886國家標(biāo)準(zhǔn)[29]，透明質(zhì)酸凝膠需進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測試。其中浸提條件：浸提介質(zhì)為10%血清細(xì)胞培養(yǎng)液，浸提比例為每0.2克樣品加1 mL浸提介質(zhì)，浸提溫度為37℃，浸提時間為24 h。采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成1×104個/mL的細(xì)胞懸液，在96孔板中加入100 μL的細(xì)胞懸浮液。在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μL的空白對照液以及透明質(zhì)酸凝膠，每組設(shè)立8個孔。并在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。接著加入20 μL噻唑藍(lán)（MTT，質(zhì)量濃度為5 mg/mL），置含 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱，在（37±2）℃下培養(yǎng) 5 h，棄去孔內(nèi)液體，并加入200 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm和630 nm處測吸光值，其結(jié)果根據(jù)細(xì)胞的相對增生率（RGR）來判斷，見表3。其中2級毒性以內(nèi)的測試材料生物安全性均符合要求。

表3 細(xì)胞相對增生率與細(xì)胞毒性的分級關(guān)系Table 3 Relationship between cell relative proliferation rate and cytotoxicity grade

1.2.8 透明質(zhì)酸凝膠的Ames試驗根據(jù)GB15193.4的要求[30]，采用平板滲入法在加與不加S9混合液的條件下對TA97、TA98、TA101和TA102共4株菌株進(jìn)行Ames試驗，并統(tǒng)計回變菌落數(shù)。受試物透明質(zhì)酸凝膠設(shè)立 4 個劑量：5、50、500、5 000 μg/皿，同時設(shè)立空白對照 （自發(fā)回變）、溶劑對照（200 μL/皿的無菌水）以及陽性對照（2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、敵克松、1，8-二羥基蒽醌）。其中每個劑量組做3個培養(yǎng)皿，并在相同條件下重復(fù)2次試驗。其結(jié)果根據(jù)回變率（MR，受試物回變菌落數(shù)/自發(fā)回變菌落數(shù)）來判斷，若MR≥2，則結(jié)果判斷為陽性結(jié)果，若MR＜2，則結(jié)果判定為陰性結(jié)果。

1.2.9 透明質(zhì)酸凝膠的溶血實驗乙醚麻醉兔后，自心臟抽取血液40 mL，加入4 mL肝素抗凝，用生理鹽水洗滌，離心至上清液不顯紅色，取2 mL上清液加入到100 mL生理鹽水中，即得2%的兔紅細(xì)胞混懸液[31]。各取凝膠1 mL，加生理鹽水至2.5 mL，在37℃恒溫水浴30 min，加2%的兔紅細(xì)胞混懸液2.5 mL，在576 nm處測其吸光值，并設(shè)立陽性對照組（蒸餾水）和陰性對照組（生理鹽水），溶血度計算如下：

一般認(rèn)為生物材料的溶血度小于5%，都是可以接受的。

2 結(jié)果與分析

2.1 透明質(zhì)酸凝膠初次交聯(lián)條件的篩選

HA的交聯(lián)條件根據(jù)降解率（R，%）的大小以及透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度來選擇。降解率越小，說明凝膠的抗酶解能力越高，結(jié)果見表4?？梢钥闯觯?組實驗得到的降解率在前3天都是最小的。通過極差分析可知，對交聯(lián)反應(yīng)的影響程度大小依次是NaOH的濃度、BDDE/HA、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度。即NaOH的濃度影響最大，溫度的影響最小。得到初次交聯(lián)的最佳條件為：反應(yīng)溫度是50℃，NaOH的濃度是 0.1 mol/L，反應(yīng)時間是 4.5 h，BDDE/HA 是 1∶2。采用此條件得到的凝膠有最好的抗酶解能力。此凝膠連續(xù)3 d的降解率分別為9.76%、16.79%、20.45%，透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度為28.84 mg/mL，接近市場現(xiàn)有水平，見表5。所以選擇此凝膠強化交聯(lián)。

表4 HA初次交聯(lián)Table 4 Primary crosslinking of HA

續(xù)表4

表5 市場上透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度及降解率Table 5 Content of HA and the degradation rate of HA with the products on the market

2.2 透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度的測定

透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度可以通過測定葡萄糖醛酸的質(zhì)量濃度來計算得到，目前市場上透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度見表5。篩選出抗酶解能力強并且透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度接近目前市場現(xiàn)有產(chǎn)品的凝膠及交聯(lián)條件。

2.3 透明質(zhì)酸凝膠強化交聯(lián)條件的篩選

以反應(yīng)溫度是50℃，CNaOH的濃度是0.1 mol/L，反應(yīng)時間是 4.5 h，BDDE/HA 是 1∶2 為條件，將得到的透明質(zhì)酸凝膠進(jìn)行強化交聯(lián)，所得的結(jié)果如表6所示。由表6可知，強化交聯(lián)對初次交聯(lián)的影響有增強作用也有減弱作用。其中第1組實驗得到的降解率最小。通過極差分析可知，對交聯(lián)反應(yīng)的影響程度大小依次是反應(yīng)時間、BDDE/HA、NaOH的濃度、反應(yīng)溫度。即反應(yīng)時間影響最大，溫度的影響最小。采用反應(yīng)溫度是35℃，CNaOH的濃度是0.05 mol/L，反應(yīng)時間是 1.5 h，BDDE/HA 是 1∶8 的條件將得到。此凝膠連續(xù)三天的降解率分別為6.85%、7.56%、12.4%，透明質(zhì)酸鈉含量為29.03 mg/mL。

表6 HA強化交聯(lián)Table 6 Enhanced-crosslinking of HA

續(xù)表6

2.4 透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)度

所得的氣相色譜圖見圖3。通過計算得到2.5 g凝膠酸解得到甘油的摩爾數(shù)分別是4.91×10-5mol和 8.53×10-5mol，HA雙糖與甘油的摩爾比約為4.2：1，假設(shè)HA的羥基與BDDE中所有的醚鍵均開環(huán)反應(yīng)，得到初次交聯(lián)得到的凝膠的交聯(lián)度為16.54%，強化交聯(lián)得到的凝膠的交聯(lián)度為54.52%。

圖3 將透明質(zhì)酸凝膠完全酸解后，通過氣相色譜測定甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（6.0 min）Fig.3 Determination of cross-link degree After an acidic hydrolyzation，the glycerol content was determined by GC chromatography，and the glycerol peak was at 6.0 min

2.5 透明質(zhì)酸凝膠的紅外光譜分析

初次交聯(lián)得到的凝膠、強化交聯(lián)得到的凝膠以及未交聯(lián)的透明質(zhì)酸的FT-IR圖譜見圖4。從圖4可以看出，在3 420-1cm附近有羥基O-H或N-H吸收峰，在1 660-1cm附近有C=O吸收峰，在1 400-1cm附近有C-N吸收峰，在1 050-1cm附近有C-O-C吸收峰。說明初次交聯(lián)、強化交聯(lián)后得到的凝膠的特征吸收峰與未交聯(lián)的透明質(zhì)酸的特征吸收峰基本一致，符合規(guī)定。

圖4 紅外光譜分析Fig.4 FT-IR spectra of different HA gels

2.6 透明質(zhì)酸凝膠的細(xì)胞毒性

通過計算得到透明質(zhì)酸凝膠的細(xì)胞相對增生率（RGR）以及毒性級別見表7。其中初次交聯(lián)所得的凝膠在570 nm和630 nm處的RGR分別為88.9%和85.6%，均大于80%，為一級毒性，強化交聯(lián)所得的凝膠的RGR在570 nm和630 nm處分別為85.5%和80.9%，均大于80%，為一級毒性，都符合要求。

表7 透明質(zhì)酸凝膠的細(xì)胞毒性分級Table 7 Cytotoxicity grade for HA gels

2.7 透明質(zhì)酸凝膠的遺傳毒性

其遺傳毒性結(jié)果見表8。可知，初次交聯(lián)和強化交聯(lián)所得的凝膠在加與不加S9混合物的條件下，其回變率（MR值）均小于2，判定為陰性結(jié)果，沒有明顯的致突變性。

表8 透明質(zhì)酸凝膠的Ames試驗（x±s，n=3）Table 8 Ames test of HA gels（x±s，n=3）

2.8 透明質(zhì)酸凝膠的溶血性

初次交聯(lián)和強化交聯(lián)所得的凝膠的溶血度見表9。其中溶血度分別為2.67%和2.60%，均小于5%，認(rèn)為具有良好的生物相容性，沒有明顯的溶血性，符合一般生物材料溶血度的要求。

表9 透明質(zhì)酸凝膠的溶血度Table 9 Hemolysis for HA gels

3 結(jié)語

通過初次交聯(lián)-強化交聯(lián)的偶聯(lián)模式來制備透明質(zhì)酸凝膠，得到初次交聯(lián)凝膠和強化交聯(lián)凝膠。設(shè)計四因素四水平的正交試驗來確定初次交聯(lián)的最佳條件：反應(yīng)溫度50℃，氫氧化鈉濃度為0.1 mol/L，反應(yīng)時間4.5 h，透明質(zhì)酸與交聯(lián)劑的摩爾比為2∶1；強化交聯(lián)的最佳條件：反應(yīng)溫度35℃，氫氧化鈉濃度為0.05 mol/L，反應(yīng)時間1.5 h，透明質(zhì)酸與交聯(lián)劑的摩爾比為8∶1。并測得凝膠的透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度從初次交聯(lián)的28.84 mg/mL上升到強化交聯(lián)的29.03 mg/mL，沒有較大的變化。分別用透明質(zhì)酸酶降解凝膠，發(fā)現(xiàn)強化交聯(lián)的凝膠的降解率下降了30%左右，交聯(lián)度提高了3倍多。其中初次交聯(lián)凝膠的抗透明質(zhì)酸酶降解效率接近市場現(xiàn)有水平，強化交聯(lián)凝膠的抗透明質(zhì)酸酶降解效率在原有水平有較大提升。通過FT-IR分析發(fā)現(xiàn)，凝膠的結(jié)構(gòu)與HA相比基本沒有變化，并且在細(xì)胞毒性、遺傳毒性、溶血試驗中，結(jié)果均符合要求。因此，本方法可以得到抗酶解能力強的凝膠，并且可以提高交聯(lián)度。但是，透明質(zhì)酸凝膠在人體內(nèi)的滯留時間需要進(jìn)一步通過實驗證明。