低苯丙氨酸山杏仁肽的制備

李志剛， 張宇靖， 張 晨， 光翠娥

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）是一種由苯丙氨酸羥化酶 （phenylalanine hydroxylase，PAH）功能障礙或四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）合成酶/二氫生物蝶呤（dihydrobiopterin，BH2）還原酶缺陷而導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳氨基酸代謝障礙性疾病[1-3]。飲食治療即控制患者日常飲食中苯丙氨酸攝入量，是目前最主要最有效的治療方式[4-5]。常見的由除苯丙氨酸外的其他游離氨基酸混合而成的配方食品，氣味難以接受，且食用后易造成人體滲透壓過高而導(dǎo)致腹瀉[6]。采用內(nèi)肽酶和外肽酶分步水解的方法釋放游離苯丙氨酸或產(chǎn)生苯丙氨酸處于末端的肽鏈，經(jīng)吸附去除苯丙氨酸后產(chǎn)物可用于為PKU患者制備特殊醫(yī)學(xué)配方食品。最常見最有效的吸附劑為活性炭。

日本學(xué)者Yamashita[7]和國內(nèi)學(xué)者周志偉[6]分別以濃縮魚蛋白和酪蛋白為原料，通過酶法水解再經(jīng)一定方式分離苯丙氨酸制備了低苯丙氨酸肽。除動物蛋白源外，小麥蛋白[8]、大米蛋白[9]及玉米蛋白[10]等也被用于制備此類肽。

作者以山杏仁蛋白為原料，通過酶法水解吸附苯丙氨酸制備低苯丙氨酸肽，為山杏仁的精深加工提高附加值提供依據(jù)，同時為開發(fā)低/無苯丙氨酸肽特殊醫(yī)學(xué)配方食品提供原料來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂山杏仁粗蛋白粉：上海問森生物科技有限公司產(chǎn)品；Alcalase 2.4L、Flavourzyme 1000L （食品級）：丹麥諾維信（Novozymes）公司產(chǎn)品；粉末活性炭：食品級，江蘇中遠(yuǎn)活性炭公司產(chǎn)品。

紫外可見光分光光度計（UV-1600）：上海美普達(dá)儀器公司產(chǎn)品；pH計、離心機：梅特勒特托利多（上海）有限公司產(chǎn)品；HS-7集熱式電磁攪拌器：IKA產(chǎn)品；K9840智能定氮儀、SH420石墨消解儀：海能儀器產(chǎn)品；DZF-6050電熱真空干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；冷凍干燥機：美國Labconoco公司產(chǎn)品；Agilent1100氨基酸專用高效液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 山杏仁蛋白的提取工藝脫脂山杏仁粗蛋白粉→調(diào)節(jié)pH至9.0→浸提→離心 （4000 r/min，20 min）→取上清液→調(diào)節(jié)pH至 4.1→離心 （5 000 r/min，15 min）→取沉淀→去離子水清洗→調(diào)節(jié)pH至7.0→真空冷凍干燥24 h→杏仁蛋白[11]。

1.3 常規(guī)成分測定

蛋白質(zhì)含量測定：GB5009.5—2010[12]，凱氏定氮法；脂肪含量測定：GB/T5009.6—2003[13]，索氏抽提法；水分含量測定：GB5009.3—2010[14]，直接干燥法；灰分含量測定：GB5009.4—2010[15]，550℃高溫灼燒法；酶活測定：QB/T 1803—93[16]。

1.4 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的測定

水解度測定采用甲醛滴定法[17]，公式如（1）所示：

式中：C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1為所取水解液經(jīng)甲醛滴定至終點pH 9.2時所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白經(jīng)甲醛滴定至pH 9.2時所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V為水解上清液體積，mL；M為水解樣品質(zhì)量，g；N為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；Htot為每克蛋白質(zhì)中所含肽鍵毫摩爾數(shù)，對于杏仁蛋白，該值取7.58 mmol/g[18]。

1.5 Flavourzyme 1000L水解單因素實驗

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%山杏仁蛋白溶液，添加2 000 U/g Alcalase 2.4 L于60℃、pH 9.0條件下水解2 h后沸水浴滅酶10 min，待冷卻后用于外肽酶水解。外肽酶水解后沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min取上清液測定不同條件下DH。

1.5.1 pH對DH的影響于55℃下添加500 U/g Flavourzyme1000L， 分別于 pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5下水解120 min，測定不同pH下的DH。

1.5.2 溫度對于DH的影響于pH 7.5、酶添加量為 500 U/g，分別在 45、50、55、60 ℃溫度下繼續(xù)水解120 min，分別測定不同溫度下DH的變化。

1.5.3 酶添加量E/S對DH的影響于pH 7.5、55℃的水解條件下， 測定 500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g 酶添加量下水解 120 min后DH的變化。

1.5.4 水解時間對DH的影響于pH 7.5、50℃、酶添加量為3 000 U/g的條件下，分別測定30、60、90、120、150、180 min 不同水解時間的 DH， 確定水解時間。

1.6 Flavourzyme 1000L水解正交實驗

通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)，水解120 min后DH基本保持不變，因此采用三因素三水平的正交實驗確定Flavourzyme 1000L的最佳水解條件。正交實驗設(shè)計見表1。

1.7 苯丙氨酸的吸附

經(jīng)雙酶分步水解后水解液6 000 r/min離心20 min，取上清液添加10 g/dL食品級粉末活性炭，于35℃、pH 2.0吸附3 h。

表1 正交實驗表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.8 氨基酸組成分析

稱取100.0 mg肽粉于水解管內(nèi)，加入8 mL 6 mol/L鹽酸，充氮封管后于120℃水解22 h，水解完成后取出冷卻加入4.8 mL 10 mol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，再轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容。雙層濾紙過濾，取1 mL濾液于1.5 mL離心管內(nèi) 1 0000 r/min離心10 min，吸取400 μL上清液于樣品瓶中進(jìn)樣測定。

液相色譜條件：Agilent Hypersil ODS柱（5 μm，4.0 mm×250 mm）； 流動相 A （pH=7.2）：27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃 （體積比為500∶0.11∶2.5）；流動相 B（pH=7.2）：80.9 mmol/L 醋酸鈉-甲醇-乙腈（體積比 1∶2∶2）；采用梯度洗脫，洗脫程序：0 min，體積分?jǐn)?shù) 8%B；17.0 min，體積分?jǐn)?shù) 50%B；20.1 min，體積分?jǐn)?shù) 100%B；24.0 min，體積分?jǐn)?shù)0%B；流動相流量為1.0 mL/min；柱溫40℃；紫外檢測器（VWD）檢測波長為 338 nm，脯氨酸于262 nm處檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)成分測定結(jié)果

提取所得山杏仁蛋白基本成分見表2。

表2 山杏仁蛋白質(zhì)基本成分Table 2 Main composition of apricot kernel protein

蛋白酶酶活測定結(jié)果見表3。

表3 蛋白酶酶活Table 3 Enzyme activity of different proteases

2.2 Flavouzryme 1000L水解單因素實驗

Alcalase2.4L是一種高效的細(xì)菌蛋白酶，能夠產(chǎn)生大量末端為疏水性氨基酸的肽類，所得水解液往往具有很強的苦味[19]。Flavourzyme 1000 L是一種兼具外肽酶和內(nèi)肽酶活性的復(fù)合蛋白酶，能有效切除肽鏈末端的疏水性氨基酸[20]，并且能對肽類進(jìn)行進(jìn)一步水解，改善水解液的風(fēng)味。

2.2.1 pH對DH的影響從圖1可以看出，在選定的pH值下，隨著pH的上升DH逐漸提高，當(dāng)pH達(dá)到7.5左右時DH最大，超過7.5后由于蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生變化，水解能力逐漸下降，因此選擇pH 7.5為其水解pH。

圖1 pH對DH的影響Fig.1 Effect of pH value on DH

2.2.2 溫度對DH的影響從圖2可以看出，在選擇的溫度參數(shù)下，DH逐漸提高，在50℃左右時水解能力最強，超過50℃后由于高溫導(dǎo)致酶的構(gòu)象發(fā)生不可逆的改變，活性開始下降，因此選擇50℃為其水解溫度。

圖2 溫度對DH的影響Fig.2 Effect of temperature on DH

2.2.3 酶添加量對DH的影響從圖3可以看出，隨著酶濃度的上升DH逐漸增大，當(dāng)添加量增加到3 000 U/g左右時再增加酶濃度DH上升變緩，這可能是由于酶與底物的作用位點達(dá)到飽和狀態(tài)，再增大酶濃度對于DH的提高貢獻(xiàn)有限，因此酶添加量選擇3 000 U/g。

圖3 酶添加量對DH的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on DH

2.2.4 水解時間對DH的影響從圖4可以看出，隨著時間的推移，能夠被Flavourzyme 1000L水解的位點逐漸減少，水解120 min后能夠被繼續(xù)水解的位點幾乎沒有，DH變化平緩，因此選擇120 min為其水解時間。

圖4 水解時間對DH的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on DH

2.3 Flavourzyme 1000L水解山杏仁蛋白最佳條件

正交實驗結(jié)果見表4。

通過極差分析可知，影響Flavourzyme 1000L水解山杏仁蛋白的主次因素為B＞A＞C（pH的影響最顯著，溫度次之，酶添加量影響最小），最佳因素水平組合為B2A2C2，即水解pH為7.5，水解溫度為50℃，酶添加量為3 000 U/g。經(jīng)測試在此工藝條件下水解120 min DH可達(dá)41.23%。

2.4 苯丙氨酸的去除及肽的氨基酸分析

常見的用于分離苯丙氨酸的方法有膜分離法、離子交換法、凝膠過濾法等，而活性炭對苯丙氨酸有著特異性的吸附能力[21]，具有廉價高效的特點，因此選用食品級粉末活性炭去除苯丙氨酸。

雙酶分步水解后所得水解液，經(jīng)活性炭吸附苯丙氨酸后，真空抽濾去除活性炭，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空干燥72 h。氨基酸組成見表5。

表4 正交實驗結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal test

表5 肽粉氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of the peptide powder

經(jīng)計算，苯丙氨酸占總氨基酸質(zhì)量的0.32%，較山杏仁蛋白所含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.01%大幅降低，同時也低于周志偉[6]等人利用酪蛋白制備低苯丙氨酸肽中質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。由于活性炭對含苯環(huán)氨基酸吸附選擇性較差，因此在利用此法生產(chǎn)低苯丙氨酸特殊食品時常常需要添加色氨酸和酪氨酸。此外，由于PKU患者飲食控制嚴(yán)格，導(dǎo)致體內(nèi)缺乏礦物質(zhì)和維生素，因此在利用此類肽制備低苯丙氨酸特殊食品時需要添加維生素、礦物質(zhì)和碳水化合物等。

3 結(jié) 語

經(jīng)過試驗，F(xiàn)lavourzyme 1000 L水解山杏仁蛋白的最佳工藝條件為水解溫度50℃、pH 7.5、添加量3 000 U/g，水解120 min后DH可達(dá)41.23%。雙酶分步水解后，水解液經(jīng)活性炭吸附，最終所得肽粉中苯丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.32%。用此法所得低苯丙氨酸肽可通過補充部分氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及碳水化合物等為PKU患者制備低苯丙氨酸特殊醫(yī)學(xué)配方食品。