頂空毛細(xì)管色譜法測定牛肺表面提取物質(zhì)中甲醇和丙酮的含量

北京市藥品檢驗(yàn)所 中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（102206）趙璇 李群 周長明

牛肺表面提取物質(zhì)是從牛肺中提取的天然肺表面活性物質(zhì)，是一種成分復(fù)雜的混合物，其制劑常用于治療新生兒呼吸窘迫癥[1]，又稱為肺透明膜病，多見于早產(chǎn)兒，是較為嚴(yán)重的低氧血癥，致殘率與致死率均較高。牛肺表面提取物質(zhì)在生產(chǎn)過程中使用了甲醇、丙酮等溶劑，而藥品中的殘留溶劑會(huì)增加藥物的毒副作用[2]。其中，“甲醇”為二類溶劑、“丙酮”為三類溶劑，均需嚴(yán)格控制[3]。《中國藥典》對(duì)此類殘留溶劑的含量也作出限制。本品現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為陳舊，殘留溶劑的方法還采用填充柱、外標(biāo)法、直接進(jìn)樣的氣相色譜方法，存在一定的局限性，靈敏度低，重現(xiàn)性差。建立了新的檢測方法，甲醇、丙酮的檢測采用頂空毛細(xì)管色譜法，內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測定。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新建立的方法靈敏度，重現(xiàn)性高，精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于生產(chǎn)中的監(jiān)控，也可用于質(zhì)量檢測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent6890型氣相色譜儀；Agilent7694型頂空進(jìn)樣器；氫火焰離子化檢測器（FID）。LC-solution色譜工作站。色譜柱DB-624（60m×0.54mm，3μm）（安捷倫公司）。

1.2 試藥 牛肺表面提取物質(zhì)（北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)為2010.6.1）；甲醇（純度99.5%），丙酮（純度100%）（北京化學(xué)試劑公司）均為色標(biāo)。

附圖 氣相色譜圖；A.對(duì)照溶液；B.供試品溶液；1.甲醇；2.丙酮；3.內(nèi)標(biāo)；4.N,N-二甲基甲酰胺

2 甲醇、丙酮?dú)埩羧軇┑臏y定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：DB-624（60m×0.54mm，3μm）；柱溫：采用程序升溫，初始柱溫50℃，保持16分鐘，以每分鐘10℃的速率升溫至200℃，保持5分鐘；進(jìn)樣口溫度為230℃，檢測器溫度：250℃；頂空瓶平衡溫度90℃，平衡時(shí)間30分鐘，進(jìn)樣1.0min。載氣：氮?dú)?；流速?ml/min；分流比：10∶1。

2.2 對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液配制 取甲醇對(duì)照品80mg、丙酮對(duì)照品130mg，精密稱定，置50ml量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取5ml，置100ml量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取正己烷12mg，精密稱定，置500ml量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋并定容至刻度，搖勻作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品25 mg，精密稱定，置頂空進(jìn)樣瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液1.0ml，迅速加蓋密閉，超聲1分鐘，作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將對(duì)照品溶液1ml，置頂空進(jìn)樣瓶中，密封進(jìn)樣，各峰與相鄰色譜峰分離度均大于18.5。另取供試品溶液進(jìn)樣，色譜結(jié)果見附圖。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液用內(nèi)標(biāo)溶液逐級(jí)稀釋，制成系列質(zhì)量濃度的溶液，精密量取各溶液1ml，置頂空瓶中，密封，搖勻，按“2.1.1”色譜條件將系列溶液分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算校正因子，以甲醇、丙酮溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)與相應(yīng)的校正因子（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)數(shù)據(jù)見附表1。

2.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，依法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果甲醇峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.84%；丙酮峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.59%。表明儀器精密度良好。

2.7 檢測限與定量限 將對(duì)照品溶液逐步稀釋，觀測各對(duì)照物質(zhì)的峰高，當(dāng)峰高為基線噪音的3倍左右時(shí)為檢測限，當(dāng)峰高為基線噪音的10倍左右時(shí)為定量限，結(jié)果見附表2。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取牛肺表面提取物質(zhì)12mg，置頂空進(jìn)樣瓶中，分別加入不同濃度的對(duì)照品溶液，迅速加蓋密閉，超聲1分鐘，依法測定，結(jié)果見附表3。

2.9 樣品檢測結(jié)果 取樣品，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，甲醇含量0.002%，丙酮含量0.001%。

附表1 線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

附表2 檢測限與定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

附表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

肺表面活性物質(zhì)是一種主要由磷脂和特異性蛋白質(zhì)[5]組成的脂蛋白復(fù)合物。磷脂含有親水基團(tuán)和親油基團(tuán)，是生物膜重要組成部分，也是天然乳化劑和表面活性劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)[3]。牛肺表面提取物質(zhì)系自新生小牛肺灌洗液提取制得的磷脂蛋白復(fù)合物，該原料制備為注射用牛肺表面活性劑常用于治療新生兒呼吸窘迫癥。其防病機(jī)制是肺表面活性物質(zhì)覆蓋在肺泡表面，能降低肺泡表面張力，防止肺泡委陷，維持肺泡毛細(xì)血管間液體平衡，防止肺水腫，還能促進(jìn)肺液清除，保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞等作用[4]。根據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作，經(jīng)查詢藥監(jiān)局?jǐn)?shù)據(jù)庫，牛肺表面提取物質(zhì)有1個(gè)廠家生產(chǎn)。我單位向生產(chǎn)廠家發(fā)函收集樣品，由于該藥品為新生兒急救類藥品，生產(chǎn)廠家僅能提供1個(gè)批次樣品。該產(chǎn)品成分復(fù)雜, 含有磷脂、蛋白質(zhì)、甘油脂、游離脂肪酸等，原方法采用直接進(jìn)樣測定，其易吸附于柱子內(nèi)，影響殘留溶劑的洗脫，對(duì)色譜柱也有損壞。參考中國藥典2015年版[3]及相關(guān)文獻(xiàn)，建立了頂空進(jìn)樣法（內(nèi)標(biāo)法）測定。內(nèi)標(biāo)法可在一定程度上消除操作條件（如進(jìn)樣量、色譜條件）的變化所引起的誤差。本方法采用正己烷作為內(nèi)標(biāo)，在選定的色譜條件下能與待測成分及干擾成分達(dá)到很好的分離。該方法操作簡便，靈敏度顯著高于現(xiàn)有方法，精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，新建立的方法可為牛肺表面提取物生產(chǎn)過程中使用甲醇、丙酮的控制提供了更加可靠準(zhǔn)確的方法，其線性、精密度、回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想，也為牛肺表面提取物及其制劑的標(biāo)準(zhǔn)提高奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。