42份云南玉米自交系基于SSR熒光標(biāo)記的遺傳多樣性分析

張 鵬，管俊嬌，黃清梅，王江民，楊曉洪，劉艷芳，張建華，毛 進(jìn)

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205)

玉米是我國重要谷物，栽培歷史已有470多年，根據(jù)歷年我國玉米的播種面積和產(chǎn)量情況，玉米已成為中國第一大糧食作物[1]。現(xiàn)今全世界約有三分之一人口以玉米作為主要食糧，其中亞洲人的食物組成中玉米占50%，世界范圍內(nèi)對玉米育種及應(yīng)用研究非常廣泛，玉米種質(zhì)資源也不斷推陳出新，就目前我國玉米審定品種數(shù)量已多達(dá)6000余個[2]。云南地處西南，擁有獨特的氣候環(huán)境，生長季與光熱水同季，玉米是云南地區(qū)的主要糧食作物[3]，近些年來云南省一直在提倡發(fā)展高原特色農(nóng)業(yè)，面對目前玉米品種種質(zhì)資源的與日俱增，對高原特色玉米遺傳種質(zhì)的來源、系譜關(guān)系及遺傳差異的分析和掌握程度，是選育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)[4]，也是品種管理的需要，同時還能為提高品種質(zhì)量和價值，避免玉米品種親緣關(guān)系混雜，規(guī)范玉米品種市場提供有力的科學(xué)理論支撐。

簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat，SSR)標(biāo)記是建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)基礎(chǔ)上的一種目前較為成熟的遺傳分子標(biāo)記，已有效應(yīng)用于玉米遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、聚類分析和基因鑒定等領(lǐng)域[5-7]，但常規(guī)的SSR標(biāo)記存在工作量大、精度低、分析量小等缺點，已無法滿足目前的試驗要求。許鯤等通過40對SSR熒光引物構(gòu)建了我國163份冬油菜指紋圖譜[8]。Sanchez-Perez等曾探討過關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管熒光電泳這3種技術(shù)各自的優(yōu)劣，最終得到聚丙烯酰胺凝膠電泳與毛細(xì)管電泳比瓊脂糖凝膠電泳更具有優(yōu)勢[9]。劉歡等利用熒光檢測技術(shù)對多花黑麥草進(jìn)行了EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建，通過研究表明，目前的檢測方法都各有優(yōu)缺點，要根據(jù)不同的試驗階段按實際需求選擇合適的檢測技術(shù)[10]。綜合3種檢測技術(shù)，SSR熒光標(biāo)記技術(shù)具有簡單易行、精度高、通量大等優(yōu)點[11-12]，為大數(shù)據(jù)的分析提供了可能。

因此，本研究采用毛細(xì)管熒光標(biāo)記技術(shù)，對收集的42份云南高原地區(qū)常用玉米自交系品種遺傳多樣性進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和系統(tǒng)分析，旨在為高原玉米種質(zhì)創(chuàng)新、品種遺傳改良、評估育種群體遺傳多樣性等育種工作提供技術(shù)支撐[13]，同時也為構(gòu)建指紋圖庫，進(jìn)一步對品種進(jìn)行規(guī)范化管理等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的42個自交系均為云南常用自交系品種，其中28個為近幾年新育成自交系，具體品種信息和品種權(quán)授權(quán)情況見表1。另外14個為參照自交系，主要為已經(jīng)公用公知的自交系品種，具體信息和系譜信息見表2。42個自交系品種使用人工氣候箱育苗，將需要試驗的種子在人工氣候箱中進(jìn)行育苗，設(shè)計3個重復(fù)，每個重復(fù)30株，待幼苗生長到3葉1心時，開始取樣，取樣從3個重復(fù)中分別進(jìn)行單株取樣，共取10個單株進(jìn)行之后的試驗。

表1 新育成自交系信息

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 在玉米苗期，每個品種取5片幼嫩葉片在液氮下混合研磨，采用CTAB法提取DNA。利用紫外分光光度計檢測提取DNA質(zhì)量并用超純水稀釋，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的篩選 根據(jù)現(xiàn)行的玉米品種鑒定DNA指紋方法(NY/T 1432─2007)推薦的40對核心引物，通過正交試驗設(shè)計從中篩選出30對用于本試驗，并且擴增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物進(jìn)行試驗，引物相關(guān)信息見表3。

1.2.3 PCR擴增 PCR擴增反應(yīng)體系與現(xiàn)行的玉米品種SSR標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1432─2007)技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，具體如下：反應(yīng)體系優(yōu)為10L，2L緩沖液優(yōu)化為1L，2L MgCl2優(yōu)化為0.6L MgCl2或不加，dNTP溶液由1.2L優(yōu)化為0.8L，Tag DNA聚合酶由0.2L優(yōu)化為0.25L，檢測樣品DNA由2L優(yōu)化為1L。如若不加入MgCl2則以等量的去無菌水代替。

反應(yīng)采用下列程序：94 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；30次擴增反應(yīng)循環(huán)(94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。形成的擴增產(chǎn)物于4 ℃下保存。

表2 參照自交系品種系譜信息

1.2.4 熒光標(biāo)記檢測 利用遺傳分析儀進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳，并使用DNA Collection Software 軟件收集原始數(shù)據(jù)。引物和熒光標(biāo)記、Tag DNA聚合酶和dNTP等試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司。使用Gene Mapper軟件對基因片段進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

試驗結(jié)果主要進(jìn)行基因型的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，擴增產(chǎn)物按“0、1、-”進(jìn)行統(tǒng)計分析，相同位置上，有條帶標(biāo)記為“1”，無條帶標(biāo)記為“0”，數(shù)據(jù)缺失標(biāo)記為“-”。數(shù)據(jù)分析使用NTsys2.11和Excel軟件來進(jìn)行分析統(tǒng)計，并計算遺傳相似系數(shù)，非加權(quán)組平均法(UPGMA,Unweight Pair Group Method Using Arithmetic Averages)進(jìn)行遺傳聚類分析。參照多態(tài)性信息量(Polymorphism Information Content)計算PIC值[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南42份常用玉米自交系SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

通過利用30對引物對42份云南常用玉米自交系進(jìn)行試驗，共檢測到277個等位基因變異，平均每個位點檢測到的等位基因數(shù)為9.2個，變化范圍4～17個，片段大小介于86～434 bp之間，每個SSR位點的多肽信息量(PIC)在0.7008～0.9979之間，平均為0.9712，其中引物bnlg1191的PIC最大為0.9979，引物umc1335y5的最小，為0.7008，但有的位點(如bnlg1671y17)等位基因數(shù)目較多，而PIC值卻較低，有的位點等位基因較少，PIC值相對較高(如bnlg490y4)，具體信息見表3。本研究中使用的30對SSR引物均勻分布在全部染色體上，都具有較高的多態(tài)性，能夠較好地反映出供試材料之間的遺傳差異及遺傳多樣性。圖1為掖502、中106、鐵7922、JC6181四個品種在引物bnlg1191的擴增帶型。

表3 42份云南常用玉米自交系等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量

2.2 云南42份常用玉米自交系遺傳多樣性分析

通過聚類結(jié)果(圖1)顯示，42個自交系遺傳相似系數(shù)均大于0.82，具體類群劃分不明顯，大部分品種遺傳相似度較高，說明不同育種單位或育種人在品種選育時所采用的親本材料遺傳基礎(chǔ)較狹窄，不同材料分散于不同小類群中，其中F880、NP5203、Y708M為來源不同的相同品種，最終聚到了一起，但遺傳相似系數(shù)不高，說明這些品種還存在品種內(nèi)的差異。其中TRL2與C8605-2最為相似，遺傳相似系數(shù)達(dá)到了0.98，主要考慮到引物的原因無法區(qū)分，或是因為品種血緣相近的姊妹系。綜31、齊318、本7884-7、鐵7922和U8112均為美國優(yōu)良自交系品種，但鐵7922和U8112分為一類，其余3個品種為一類。JC6181和中106與其他品種分開，JC181的遺傳背景不詳，而且沒有通過品種授權(quán)，中106則屬于塘四平頭類群，但與其他塘四平頭類群的品種，例如黃早4和掖502沒有劃分為一類，具體原因還有待進(jìn)一步分析。

圖1 4個品種在引物bnlg1191的擴增帶型

3 結(jié)論與討論

由于玉米屬于異花授粉植物，遺傳多樣性越高，遺傳差異越大，得到高雜種優(yōu)勢的可能性越大。研究玉米品種的遺傳多樣性是選育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)，在玉米種質(zhì)創(chuàng)新和利用工作中具有重要意義[15-16]。但由于目前大部分的品種都由骨干自交系而來，加上在環(huán)境壓力和人為選擇導(dǎo)致同一單位選育的品種遺傳相似度較高，品種遺傳多樣性不夠豐富，云南省豐富資源還沒有被完全挖掘利用[17]，導(dǎo)致新育成的玉米品種遺傳背景相似、血緣關(guān)系相近，不利于品種的創(chuàng)新和種業(yè)的發(fā)展，因此需要在自交系的有效利用、品種資源評價、共享和交流等方面開展相關(guān)工作。

應(yīng)用SSR標(biāo)記對42份云南常用玉米自交系的遺傳多樣性進(jìn)行分析，通過遺傳距離聚類綜合分析，可對42份玉米自交系進(jìn)行類群劃分，進(jìn)一步明確所用種質(zhì)資源的雜優(yōu)類群利用方向，為玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制和玉米新品種的選育提供理論依據(jù)。