基于CO I基因的DNA條形碼技術(shù)在石首魚(yú)科魚(yú)類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用

徐春燕，劉 勇，馬 超，莊之棟，沈長(zhǎng)春，蔡建堤

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

石首魚(yú)科(Sciaenidae)隸屬于硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)，是鱸形目中屬種數(shù)量較多的科，據(jù)記載，全世界約有70屬270種[1]，在中國(guó)沿海約有18個(gè)屬35個(gè)種[2-3]。很多石首魚(yú)類具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，大黃魚(yú)和小黃魚(yú)曾經(jīng)是我國(guó)海洋漁業(yè)主要的捕撈魚(yú)種，與帶魚(yú)和曼氏無(wú)針烏賊并稱中國(guó)四大海產(chǎn)，其他種類如叫姑魚(yú)、白姑魚(yú)、黃姑魚(yú)等也都是重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。

石首魚(yú)科魚(yú)類種、屬間的區(qū)別在外形上不明顯，傳統(tǒng)的分類鑒定需要結(jié)合內(nèi)部的解剖特征，導(dǎo)致物種鑒定困難，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)誤判。利用DNA條形碼技術(shù)可以避開(kāi)樣品形態(tài)特征因素的影響，從而進(jìn)行更為準(zhǔn)確的物種鑒定。該技術(shù)作為魚(yú)種鑒定的一種便捷有效的方式，可以鑒定出傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法不能或錯(cuò)誤鑒定的潛在魚(yú)種，用來(lái)對(duì)魚(yú)類形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充和修訂，提高形態(tài)鑒定的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)合測(cè)序的石首魚(yú)科CO I基因序列與GenBank下載的同源序列，通過(guò)比較該序列在種內(nèi)和種間的差異，并構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，探討該基因在石首魚(yú)科魚(yú)類鑒定中的可行性，為石首魚(yú)科物種有效鑒定提供分子水平的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品及來(lái)源

福建省水產(chǎn)研究所在漳浦、東山等地開(kāi)展?jié)O業(yè)資源動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)調(diào)查工作，本研究使用的皮氏叫姑魚(yú)(Johniusbelengerii)、尖頭黃鰭牙魚(yú)或(Chrysochiraureus)和大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)3個(gè)種類的石首魚(yú)科樣品來(lái)自漳浦監(jiān)測(cè)船“閩漳漁05308號(hào)”2017年1月的漁獲，白姑魚(yú)(Argyrosomusargentatus)、大頭白姑魚(yú)(A.macrocephalus)、截尾白姑魚(yú)(A.aneus)和斑鰭白姑魚(yú)(A.pawak)4個(gè)種類為東山監(jiān)測(cè)船“閩東漁62289號(hào)”2017年8月的漁獲。樣品經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，取背部肌肉保存于95%的酒精之中，以備開(kāi)展分子生物學(xué)研究。

另外從GenBank下載其余47個(gè)個(gè)體的石首魚(yú)科魚(yú)類CO I基因序列，與本研究所使用的7種18個(gè)個(gè)體共計(jì)14屬23種65個(gè)個(gè)體一起分析。選擇同目金線魚(yú)科的金線魚(yú)(Nemipterusvirgatus)、石斑魚(yú)科的青石斑魚(yú)(Epinephelusawoara)和鲾科的鹿斑鲾(Leiognathusruconius)共5條同源序列作為外群。本研究所用石首魚(yú)科樣品的種類、來(lái)源和數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 本研究所用石首魚(yú)科樣品的種類和來(lái)源

注：樣品來(lái)源中樣品后面的數(shù)字表示同種類中該樣品的編號(hào)。

Note：The number behinds the samples indicated the No.of samples in the same species.

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

使用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取基因組DNA，提取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增引物為：Fish F1：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′，F(xiàn)ish R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′[4]。反應(yīng)體系為25 μL，包含：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，0.3 μL Taq酶，DNA模板1 μL，其余用超純水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為94℃ 預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸9 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，選取條帶單一明亮的PCR產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列分析

將所得序列同時(shí)在NCBI(National Center for Biotechnology Information)和BOLD(Barcode of Life Database)網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性。經(jīng)核實(shí)的序列與GenBank下載的序列一起利用Clustal W進(jìn)行校對(duì)，排序后去除兩端冗余序列，保留共有序列區(qū)域進(jìn)行分析。用MEGA6.0軟件[5]分析所獲序列堿基組成、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單突變位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換顛換頻率等參數(shù)，基于Kimura-2-parameter雙參數(shù)模型(K2P)計(jì)算遺傳距離[6]，利用鄰接法(Neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，鄰接法分支數(shù)的可信度采用Bootstrap檢驗(yàn)，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)其置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

本研究對(duì)7個(gè)種類石首魚(yú)科樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序，最終獲得18條CO I基因序列，所獲序列長(zhǎng)度均為655 bp(不含引物區(qū))。將本研究所得18條序列與GenBank下載的47條同源序列比對(duì)，保留共有序列596 bp進(jìn)行分析。結(jié)果表明，石首魚(yú)科14屬23種65個(gè)個(gè)體的CO I序列的平均堿基組成為T 28.1%、C 29.8%、A 23.2%、G 18.9%，其中A+T 含量(51.3%)高于G+C含量(48.7%)，表現(xiàn)出反G偏倚，吻合脊椎動(dòng)物線粒體DNA特征[7]。A、T、G、C在1、2、3位點(diǎn)的平均含量差別很大，密碼子的堿基使用頻率存在明顯的偏向性。第1個(gè)密碼子位點(diǎn)G+C含量(57.0%)顯著高于第2和第3密碼子位點(diǎn)(44.4%和45.3%)，各密碼子堿基組成表現(xiàn)出明顯的差異性(表2)。

表2 23種石首魚(yú)科魚(yú)類CO Ⅰ基因序列堿基組成

所分析序列共含有保守位點(diǎn)331個(gè)，變異位點(diǎn)265，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)260個(gè)，單突變位點(diǎn)5個(gè)。全部位點(diǎn)中包括不變位點(diǎn)493個(gè)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)69個(gè)，顛換位點(diǎn)34個(gè)，轉(zhuǎn)換明顯大于顛換，轉(zhuǎn)換與顛換之比值(R值)為2.03，R值大于2表明序列突變未飽和，可以進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[5]。其中不變位點(diǎn)屬第2密碼子位點(diǎn)最多，為197個(gè)；而轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)均屬第3密碼子位點(diǎn)最多，分別為60個(gè)和30個(gè)(表3)。

表3 23種石首魚(yú)科魚(yú)類CO Ⅰ基因堿基變異情況

2.2 遺傳距離

利用MEGA6軟件，基于K2P模型計(jì)算23種石首魚(yú)科魚(yú)類種內(nèi)和種間的遺傳距離，結(jié)果如表4。石首魚(yú)科種內(nèi)遺傳距離為0～0.014，平均種內(nèi)遺傳距離為0.004，4個(gè)種類皮氏叫姑魚(yú)、小牙潘納石首魚(yú)、大黃魚(yú)、黑鰓梅童魚(yú)的種內(nèi)遺傳距離為0，棘頭梅童魚(yú)的種內(nèi)遺傳距離最大。除單序列的褐毛鲿、黃唇魚(yú)和淺色黃姑魚(yú)，其余20種魚(yú)類的種內(nèi)遺傳距離均在物種的種內(nèi)遺傳距離范圍之內(nèi)(≤0.020)。種間遺傳距離0.050～0.368，均大于Hebert等推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020[8]，平均種間遺傳距離為0.202，是種內(nèi)遺傳距離的50.5倍。褐毛鲿與雙棘黃姑魚(yú)的種間遺傳距離最小，皮氏叫姑魚(yú)與雙棘黃姑魚(yú)的種間遺傳距離最大。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于石首魚(yú)科14屬23種65條CO I基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)。從種的分類水平看，除僅有單一序列的物種褐毛鲿、黃唇魚(yú)和淺色黃姑魚(yú)單系性暫不能確定外，其余20個(gè)種類的不同個(gè)體均聚為同一分支，各自形成單系。從屬的水平來(lái)看，黃魚(yú)屬、梅童魚(yú)屬有明顯的單系性，與形態(tài)分類結(jié)果一致。白姑魚(yú)屬、黃姑魚(yú)屬、叫姑魚(yú)屬?zèng)]有呈現(xiàn)明顯的單系性，白姑魚(yú)屬的白姑魚(yú)、斑鰭白姑魚(yú)、大頭白姑魚(yú)聚在一支，但與截尾白姑魚(yú)的系統(tǒng)位置較遠(yuǎn)；黃姑魚(yú)屬的雙棘黃姑魚(yú)與淺色黃姑魚(yú)和黃姑魚(yú)并未聚在一起；叫姑魚(yú)屬的杜氏叫姑魚(yú)與皮氏叫姑魚(yú)和團(tuán)頭叫姑魚(yú)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表4 石首魚(yú)科23種魚(yú)類的種間和種內(nèi)遺傳距離

注：1.團(tuán)頭叫姑魚(yú)Johniusamblycephalus；2.皮氏叫姑魚(yú)Johniusbelengerii；3.杜氏叫姑魚(yú)Johniusdussumieri；4.褐毛鲿Megalonibeafusca；5.黃唇魚(yú)Bahabaflavolabiata；6.小牙潘納石首魚(yú)Pannamicrodon；7.勒氏短須石首魚(yú)Umbrinarusselli；8.紅牙魚(yú)或Otolithesruber；9.尖頭黃鰭牙魚(yú)或Chrysochiraureus；10.淺色黃姑魚(yú)Nibeachui；11.黃姑魚(yú)Nibeaalbiflora；12.雙棘黃姑魚(yú)Nibeadiacanthus；13.截尾白姑魚(yú)Argyrosomusaneus；14.大頭白姑魚(yú)Argyrosomusmacrocephalus；15.斑鰭白姑魚(yú)Argyrosomuspawak；16.白姑魚(yú)Argyrosomusargentatus；17.黑姑魚(yú)Atrobuccanibe；18.魚(yú)免Miichthysmiiuy；19.大黃魚(yú)Larimichthyscrocea；20.小黃魚(yú)Larimichthyspolyactis；21.眼斑擬石首魚(yú)Sciaenopsocellatus；22.棘頭梅童魚(yú)Collichthyslucidus；23.黑鰓梅童魚(yú)Collichthysniveatus。

3 討論

3.1 DNA條形碼在石首魚(yú)科物種鑒定中的適用性

利用CO I基因序列對(duì)物種進(jìn)行鑒定，主要依據(jù)是：1)種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離約10倍以上[9]；2)研究表明，物種內(nèi)的遺傳距離很少有大于0.020的，大部分的種內(nèi)遺傳距離小于0.010，0.020常作為DNA條形碼物種劃分的標(biāo)準(zhǔn)[8]。

本研究除單序列的種類，其余石首魚(yú)科魚(yú)類種內(nèi)遺傳距離(0～0.014)均小于0.020，平均種內(nèi)遺傳距離為0.004，符合Hebert等提出的種內(nèi)遺傳距離的標(biāo)準(zhǔn)。種間遺傳距離為0.050～0.368，23種石首魚(yú)科魚(yú)類的種間遺傳距離均大于種間0.020遺傳差異界限，平均種間遺傳距離為0.202，是平均種內(nèi)遺傳距離的50.5倍，說(shuō)明CO I基因序列可以用來(lái)對(duì)石首魚(yú)科魚(yú)類進(jìn)行有效的物種鑒定。

3.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究基于CO I基因構(gòu)建石首魚(yú)科系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，除僅有單一序列的物種外，其余石首魚(yú)科魚(yú)類的同種不同個(gè)體均聚在同一分支，形成單系。在屬內(nèi)種間系統(tǒng)分類關(guān)系中，黃魚(yú)屬、梅童魚(yú)屬的物種均能聚在一起，形成屬級(jí)階元的分支，但白姑魚(yú)屬、黃姑魚(yú)屬、叫姑魚(yú)屬物種沒(méi)有形成單系。白姑魚(yú)屬的白姑魚(yú)、斑鰭白姑魚(yú)、大頭白姑魚(yú)聚在一支，但與截尾白姑魚(yú)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與之前的研究結(jié)果一致[10-11]。黃姑魚(yú)屬的淺色黃姑魚(yú)和黃姑魚(yú)聚為一支，但與雙棘黃姑魚(yú)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與陳泉梅的研究結(jié)果一致，其認(rèn)為應(yīng)將雙棘黃姑魚(yú)從黃姑魚(yú)屬中分出[10]。叫姑魚(yú)屬的皮氏叫姑魚(yú)和團(tuán)頭叫姑魚(yú)形成單系，但杜氏叫姑魚(yú)與紅牙魚(yú)或聚在一支且與叫姑魚(yú)屬其他種類系統(tǒng)關(guān)系較遠(yuǎn)，這與傳統(tǒng)分類學(xué)分歧較大。叫姑魚(yú)屬是石首魚(yú)科種類較多的屬，呂金磊的研究認(rèn)為目前基于形態(tài)學(xué)特征的叫姑魚(yú)屬分類較為混亂，可能存在一定的問(wèn)題[11]，有關(guān)叫姑魚(yú)屬物種間的親緣關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

1)本研究比較了23種石首魚(yú)科魚(yú)類CO I基因種內(nèi)和種間的差異，并構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，線粒體CO I基因可以實(shí)現(xiàn)石首魚(yú)科魚(yú)類的有效鑒定，并且可以用來(lái)進(jìn)行屬、種水平的系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)種類齊全和鑒定準(zhǔn)確是應(yīng)用DNA條形碼對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的前提，為了更好地發(fā)揮DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定中的作用，DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)在數(shù)量和質(zhì)量上亟需完善，以達(dá)到物種鑒定更加準(zhǔn)確的需求。