絲素蛋白/殼聚糖微球制備及其抗菌性能

張治斌， 李 剛， 毛森賢， 厲巽巽， 陳玉霜， 毛青山， 李 翼， 潘志娟， 王曉沁

(1. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州大學(xué) 現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 江蘇蘇州 215123； 3. 浙江真愛美家股份有限公司， 浙江 金華 322000； 4. 曼切斯特大學(xué) 材料學(xué)院， 曼切斯特 M139PL)

近年來(lái)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)紡織品的功能性越來(lái)越重視，尤其是紡織品的抗菌、抗靜電、舒適性能等方面。目前，紡織品的抗菌整理劑可分為無(wú)機(jī)抗菌劑、有機(jī)抗菌劑、天然抗菌劑3種：無(wú)機(jī)抗菌劑主要分為金屬元素抗菌劑[1]和光催化抗菌劑[2]2類，該類抗菌劑具有廣譜抗菌、持續(xù)性好、耐熱性好等特點(diǎn)，但其添加量大，成本高且易變色；有機(jī)抗菌劑與部分無(wú)機(jī)抗菌劑相比，其殺菌能力強(qiáng)，種類多，價(jià)格低廉，如季銨鹽類[3]、胍類[4]和苯酚類等，但其部分抗菌劑存在毒性大，耐熱性差，易水解等缺點(diǎn)，限制了此類抗菌劑在紡織領(lǐng)域的應(yīng)用；更為嚴(yán)重的是此類抗菌劑的大量使用可能會(huì)使微生物產(chǎn)生耐藥性，降低抗菌劑的抗菌效果，所以近年來(lái)有機(jī)抗菌劑的需求量逐漸降低。天然抗菌劑包括植物源抗菌劑和動(dòng)物源抗菌劑2種，其中植物源抗菌劑來(lái)自艾蒿、茶葉、甘草等；動(dòng)物源抗菌劑主要是從蝦殼、蟹殼和貝殼中提取的殼聚糖[5]。

微膠囊抗菌整理技術(shù)是將抗菌藥物包埋膠囊中，然后采用浸漬法或噴涂法將膠囊黏附纖維表面，使其在一定的條件下緩慢釋放抗菌藥物，從而達(dá)到持久的抗菌效果。這種抗菌整理常在后整理加工中使用，具有抗菌效果持久、高效、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[6]。如今微膠囊技術(shù)已廣泛應(yīng)用于織物的防紫外線、抗菌防臭、抗靜電等功能整理[7]。例如，將蘆薈、殼聚糖、茶葉等天然抗菌劑包覆制成的微膠囊整理滌綸織物，不僅可使滌綸織物獲得抗菌、抗靜電、保健等功能，還可提高抗菌劑的耐用性。

殼聚糖(CS)是一種來(lái)源豐富、生物相容性好、抗菌性能強(qiáng)的天然聚合物，已被廣泛地用于化妝品、醫(yī)藥和生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域[8]。殼聚糖溶液整理織物后，由于溶液中含有大量的氨基，這些氨基可與細(xì)菌中帶負(fù)電的物質(zhì)結(jié)合，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[9]。殼聚糖整理后的紡織品具有優(yōu)異的抗菌性能，但其單獨(dú)使用會(huì)影響織物手感且抗菌耐久性差[10]。絲素蛋白(SF)富含18種氨基酸，其中丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)約占總組成的80%以上[11]。同時(shí)，絲素蛋白具有很好的透氣透濕性、緩釋性和親水性等理化性能，因此，絲素蛋白處理織物可一定程度地提高織物的吸濕性、抗靜電性和舒適性[12]。本文將絲素蛋白與殼聚糖進(jìn)行結(jié)合制備抗菌微球，同時(shí)分析了不同比例下絲素蛋白和殼聚糖制備微球的結(jié)構(gòu)和性能，以期使殼聚糖的抗菌功能更加持久，增強(qiáng)紡織品的抗菌持久性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

桑蠶絲，嵊州市協(xié)和絲綢有限公司；乙酸、聚乙二醇(相對(duì)分子質(zhì)量為10 000)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖，阿拉丁生化科技股份有限公司；金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。無(wú)水碳酸鈉、溴化鋰，化學(xué)鈍。

S-4800型掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；Thermo Nicolet 5700 型紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司；X′Pert-Pro MRD 型X射線衍射儀，荷蘭飛利浦公司；Q600熱重/差示掃描量熱聯(lián)用儀，美國(guó)TA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絲素蛋白/殼聚糖微球的制備

將30 g桑蠶絲放入12 L含有25.44 g無(wú)水碳酸鈉沸水中進(jìn)行30 min的脫膠處理，每10 min對(duì)蠶絲攪拌1次，之后將蠶絲取出沖洗3遍，放在通風(fēng)櫥中干燥。將脫膠蠶絲浸入100 mL的溴化鋰溶液(濃度為9.3 mol/L)中，并置于60 ℃烘箱中充分溶解，之后將得到的溶液裝入透析袋在去離子水中透析36 h，然后將透析溶液進(jìn)行離心處理(轉(zhuǎn)速為 9 000 r/min，時(shí)間為20 min)，去除雜質(zhì)得到絲素蛋白溶液[13]，最后對(duì)其進(jìn)行高溫高壓滅菌處理得到無(wú)菌的絲素蛋白溶液。將殼聚糖溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中制備殼聚糖溶液；選擇絲素蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，殼聚糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，殼聚糖溶液與絲素蛋白溶液的體積比為1∶1、1∶2、1∶3和 1∶4，混合均勻后再加入聚乙二醇溶液，充分混合于室溫下靜置12 h，制備得到絲素蛋白/殼聚糖抗菌微球。

1.2.2 微球二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)試

取適量絲素/殼聚糖微球放入裝有溴化鉀的研缽中研磨均勻，壓片并用紅外光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

利用X射線衍射儀對(duì)絲素/殼聚糖微球的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)試，其中衍射角范圍為5°～45°，電流為30 mA，管電壓為40 kV，掃描速度為6(°)/min。

1.2.3 微球表面形貌觀察

通過(guò)導(dǎo)電膠將超聲清洗的硅片黏在電鏡臺(tái)上，之后在硅片上滴加絲素/殼聚糖溶液，通風(fēng)干燥后對(duì)其噴金處理90 s，使用掃描電子顯微鏡觀察溶液成球性能。

1.2.4 微球的平均粒徑測(cè)試

將樣品的掃描電鏡圖片導(dǎo)入Image J軟件中，隨機(jī)選取100個(gè)微球進(jìn)行測(cè)量，將測(cè)量的結(jié)果導(dǎo)出后用Origin繪制柱狀圖并計(jì)算樣品的平均粒徑及方差。

1.2.5 微球的熱穩(wěn)定性測(cè)試

取絲素/殼聚糖微球粉末5 mg裝載在鋁盤中，使用熱重/差示掃描量熱聯(lián)用儀進(jìn)行分析，在N2條件下進(jìn)行檢測(cè)，其中升溫范圍為40～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.2.6 微球的抗菌性能表征

按GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評(píng)價(jià)第3部分：震蕩法》測(cè)定絲素/殼聚糖微球的抗菌性能，檢測(cè)菌種選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，試樣的定量抗菌活性以抑菌率表示，其計(jì)算公式為

式中：X為抑菌率，%；W為對(duì)照樣培養(yǎng)皿上的平均菌落數(shù)；Q為絲素/殼聚糖微球培養(yǎng)皿上的平均菌落數(shù)。

2 結(jié)果及討論

2.1 微球的表面形貌和尺寸分析

保持殼聚糖、絲素溶液濃度不變，改變絲素與殼聚糖的比例制備微球，其掃描電鏡照片如圖1所示。

圖1 不同CS和SF體積比的微球掃描電鏡照片

從微球的表面形態(tài)來(lái)看，CS和SF體積比為 1∶1 所制備的微球相互黏連在一起，成球性較差，聚集現(xiàn)象比較明顯，可能是殼聚糖溶液具有一定的黏度，從而導(dǎo)致不規(guī)則微球間發(fā)生黏連形成塊狀，也有可能是絲素蛋白/殼聚糖混合液中加入聚乙二醇溶液后混合不夠均勻，因此，微球無(wú)法形成規(guī)則的球體[14]。CS和SF體積比為1∶2、1∶3和1∶4所制備的微球形貌良好，其表面形態(tài)均比較平滑，規(guī)則，積聚現(xiàn)象緩解，分散性好。殼聚糖含量較高時(shí)所形成的微球其粒徑較小，隨著絲素蛋白含量的增加，所形成的微球其平均粒徑逐漸變大，粒徑由(0.47 ± 0.21) μm逐漸增加到(0.90 ± 0.18)μm。

2.2 微球的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

不同CS和SF體積比的絲素蛋白/殼聚糖微球的X射線衍射光譜如圖2所示。絲素蛋白silk I的主要衍射峰為12.2°、19.7°、24.7°和28.2°等；silk II的主要衍射峰是9.1°、18.9°、20.7°和24.3°[15]。從圖中可以看出，空白的絲素蛋白微球主要衍射峰出現(xiàn)在12.2°和19.7°處，表明其主要為無(wú)定型結(jié)構(gòu)，結(jié)晶較少。絲素蛋白/殼聚糖微球的主要衍射峰出現(xiàn)在18.9°和20.7°處，隨著殼聚糖與絲素比例的降低，silk II衍射峰在18.9°處的強(qiáng)度明顯增加。說(shuō)明其結(jié)晶結(jié)構(gòu)由silk I轉(zhuǎn)變?yōu)閟ilk II，這可能是殼聚糖中的酸性物質(zhì)誘導(dǎo)絲素蛋白由無(wú)規(guī)卷曲向穩(wěn)定的 β-折疊轉(zhuǎn)變[16]。

圖2 不同CS和SF體積比的微球X射線衍射光譜圖

絲素蛋白、殼聚糖及絲素蛋白/殼聚糖微球的紅外光譜如圖3所示。

圖3 絲素蛋白、殼聚糖及絲素蛋白/殼聚糖微球的傅里葉變換紅外光譜圖

已知，β-折疊吸收峰在1 637～1 616 cm-1范圍內(nèi)，無(wú)規(guī)卷曲的吸收峰在1 655～1 638 cm-1范圍內(nèi)，α-螺旋的吸收峰在1 662～1 656 cm-1范圍內(nèi)[17]。由圖3可知：絲素蛋白微球在 1 655 cm-1處出現(xiàn)特征峰，其主要以silk I結(jié)構(gòu)存在；而絲素蛋白/殼聚糖微球在1 628 cm-1處出現(xiàn)特征峰，發(fā)生了偏移，說(shuō)明絲素蛋白殼聚糖微球的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了改變，由silk I結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)閟ilk II結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象與XRD譜圖結(jié)果顯示一致；1 655和1 628 cm-1處特征峰在不同比例制備的微球中并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，說(shuō)明絲素蛋白與殼聚糖的酰胺基I未解離；同時(shí)，1 155 cm-1處為殼聚糖中C—O—C吸收峰，1 094 cm-1處為殼聚糖中二級(jí)醇羥基υ(C—O)吸收峰，表明絲素蛋白/殼聚糖微球中存在殼聚糖[18]。

2.3 微球的熱穩(wěn)定性能分析

絲素蛋白、殼聚糖以及體積比為1∶1的絲素蛋白/殼聚糖微球的熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果如圖4所示?？芍簹ぞ厶窃?00 ℃左右有1個(gè)質(zhì)量損失峰，為殼聚糖中水分蒸發(fā)，在120～280 ℃之間未發(fā)生明顯變化，之后樣品的質(zhì)量開始快速減少；同樣，純絲素蛋白微球在100 ℃左右有1個(gè)質(zhì)量損失峰，為絲素蛋白中水分蒸發(fā)，在120～280 ℃范圍未發(fā)生明顯變化，繼續(xù)增加溫度在280～450 ℃范圍內(nèi)樣品開始快速降解；絲素蛋白/殼聚糖微球在80 ℃左右有1個(gè)質(zhì)量損失峰，為微球中水分蒸發(fā)，在100～280 ℃區(qū)間未發(fā)生明顯變化，在280～380 ℃間樣品開始降解，這可能主要是微球外層的絲素蛋白和水分蒸發(fā)所導(dǎo)致的，在380～440 ℃質(zhì)量迅速流失，其主要為絲素蛋白/殼聚糖微球中殼聚糖的降解。絲素/殼聚糖微球中，殼聚糖的降解溫度升高，主要是由于絲素蛋白包裹著殼聚糖，使其在溫度升高的過(guò)程中外層的絲素蛋白先降解，之后包裹的殼聚糖開始降解，也進(jìn)一步說(shuō)明了微球起到了很好的穩(wěn)定的作用。

圖4 絲素蛋白、殼聚糖及絲素蛋白/殼聚糖微球的熱穩(wěn)定性曲線

由圖4可知，絲素蛋白的熱穩(wěn)定性優(yōu)于殼聚糖，由絲素/殼聚糖微球的熱穩(wěn)定性曲線可以看出，第2階段絲素蛋白的質(zhì)量損失速率變緩慢，說(shuō)明微球中外層絲素蛋白的穩(wěn)定性優(yōu)于純絲素蛋白，這主要是由于微球中絲素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，由silk I(無(wú)定形區(qū))結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定silk II(結(jié)晶區(qū))結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高外層絲素蛋白的熱穩(wěn)定性。當(dāng)外層的絲素蛋白被降解完全后，穩(wěn)定性差的殼聚糖在高溫下會(huì)被充分的分解，且由微球的熱穩(wěn)定性曲線發(fā)生質(zhì)量損失主要是由熱穩(wěn)定性差的殼聚糖造成的，因此，制備的絲素蛋白/殼聚糖微球的質(zhì)量損失率多于殼聚糖和絲素蛋白。同時(shí)從圖中還可以看出，微球的初始分解溫度為280 ℃左右，可滿足后期微球功能整理加工溫度的要求。

2.4 微球的抗菌性能分析

采用振蕩法測(cè)定了空白絲素微球和絲素蛋白/殼聚糖微球的抗菌效果，結(jié)果如圖5～7所示。

圖5 SF和CS/SF微球?qū)Υ竽c桿菌的抗菌效果

圖6 SF和CS/SF微球?qū)瘘S色葡萄球菌的抗菌效果

圖7 不同CS和SF體積比的微球的抗菌性能

由圖5、6 可以看出，大量的細(xì)菌在絲素微球培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)，表明其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒(méi)有抗菌效果。而絲素蛋白/殼聚糖微球中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)呈現(xiàn)一定程度減少(見圖5、6)，當(dāng)CS與SF體積比為1∶1時(shí)，制備的微球具有較強(qiáng)的抗菌活性，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為(84±1.2)%，對(duì)大腸桿菌的抑菌率為(86±2.8)%，而CS與SF體積比為1∶2所制備的微球?qū)瘘S色葡萄球菌(80±2.6)%和大腸桿菌(82±4.2)%的抑菌效果明顯減小(p<0.05)，并且隨著二者比例的增加，微球中殼聚糖含量的減少，從而導(dǎo)致微球的抗菌性能減弱。殼聚糖具有一定的抗菌效果主要是由于殼聚糖大分子上的氨基在酸性條件下吸附H+形成NH3+，并與帶負(fù)電的微生物細(xì)胞壁吸附，導(dǎo)致細(xì)胞壁溶解和破裂[19]。

2.5 微球的成球機(jī)制

絲素蛋白分子主要是由大量的親水和疏水片段構(gòu)成。絲素在有機(jī)溶劑、不同pH值和超聲等外界條件下能夠通過(guò)分子間自組裝形成穩(wěn)定的不溶于水的材料，因此，絲素中加入PEG后可以誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)由silk I轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定silk II結(jié)構(gòu)，形成不溶于水的絲素微球。圖8示出絲素/殼聚糖成球機(jī)制圖?？芍?，當(dāng)絲素中的大量疏水性氨基酸與親水性的PEG混合時(shí)產(chǎn)生相分離，絲素在連續(xù)相PEG中形成分散相液滴，并且PEG將分散相中的游離水和絲素表面的結(jié)合水吸到連續(xù)相中，使失去水分子的絲素暴露疏水區(qū)，在疏水作用力下，絲素逐漸聚集并沉淀析出形成穩(wěn)定的絲素微球[20]，而絲素成球的過(guò)程中會(huì)將殼聚糖包裹在內(nèi)部形成絲素/殼聚糖微球。

圖8 絲素/殼聚糖成球機(jī)制圖

3 結(jié) 論

本文制備了一種絲素蛋白/殼聚糖抗菌微球，并探討了微球的形貌結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性及抗菌性能。研究結(jié)果表明：當(dāng)絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，殼聚糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，殼聚糖溶液與絲素蛋白溶液的體積比為1∶2，得到的微球的成形性好，表面光滑，抗菌效果較好，對(duì)大腸桿菌抑菌率為(82±4.2)%；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為(80±2.6)%。由微球的FT-IR和XRD可知，相較于純絲素蛋白微球，所制備的絲素蛋白/殼聚糖微球的構(gòu)象發(fā)生了改變，由silk I轉(zhuǎn)變?yōu)閟ilk II。熱穩(wěn)定性能分析結(jié)果表明絲素/殼聚糖微球的熱分解起始溫度大于 250 ℃，具有良好的熱穩(wěn)定性。該絲素蛋白/殼聚糖抗菌微球在紡織品的后整理中具有一定的潛在價(jià)值。