重組果聚糖蔗糖酶的發(fā)酵優(yōu)化及應(yīng)用

唐 煜 ，陳 晟 ，段緒果 ，吳 敬 ， 吳 丹 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

果聚糖蔗糖酶是一種果糖基蔗糖轉(zhuǎn)移酶，屬于糖苷酶家族GH68。果聚糖蔗糖酶具有轉(zhuǎn)糖基和水解活性，大部分果聚糖蔗糖酶具有廣泛的受體專(zhuān)一性，在轉(zhuǎn)糖基過(guò)程中是以蔗糖作為其優(yōu)先選擇的底物供體，以木糖、蔗糖、乳糖等為受體，催化來(lái)自于蔗糖的果糖殘基到受體上從而生成木蔗糖、低聚乳果糖和低聚果糖等產(chǎn)物。由于低聚果糖、低聚乳果糖等低聚糖對(duì)人體健康有益[1]，因此，果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌可以產(chǎn)果聚糖蔗糖酶，如丁香假單胞桿菌（Pseudomonassyringae）[2]、多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）[3]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[4]、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonasmobilis）[5-6]、淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[7]、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）[8]、粘性放線(xiàn)菌（Actinomycesviscosus）[9]、腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）[10]等。不同的細(xì)菌產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的能力也各有差異，所產(chǎn)果聚糖蔗糖酶對(duì)受體的專(zhuān)一性及酶轉(zhuǎn)化獲得的產(chǎn)物性質(zhì)也有較大區(qū)別。

低聚乳果糖（lactosucrose，LS）是一種三糖（見(jiàn)圖1），由β-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷和 β-D-呋喃果糖苷殘基組成，可以被看作是一分子乳糖與一分子果糖的縮合物，或者是一分子半乳糖與一分子蔗糖的縮合物，其化學(xué)名稱(chēng)應(yīng)為β-D-半乳糖基蔗糖，但習(xí)慣上，人們將其稱(chēng)為低聚乳果糖。低聚乳果糖是一種功能性低聚糖，易溶于水，甜度約為蔗糖的70%，幾乎不被生物體消化和吸收，是雙歧桿菌的有效增殖因子，其增值效果比其他功能性低聚糖如低聚果糖、低聚半乳糖等更好[11-12]。低聚乳果糖同時(shí)具有低熱量、低齲齒、降低血液中的膽固醇、改善血脂、促進(jìn)鈣吸收等特殊的生理功能，可作為一種功能保健食品。國(guó)內(nèi)對(duì)低聚乳果糖做了初步研究[13]，還沒(méi)有工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道，而在日本低聚乳果糖已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)多年。由于其具有廣闊的應(yīng)用前景，近年來(lái)低聚乳果糖的研究開(kāi)發(fā)受到了極大的重視。

利用微生物來(lái)源的酶制備低聚乳果糖具有成本低、穩(wěn)定性高、提取方便等特點(diǎn)。使用果糖基轉(zhuǎn)移酶將蔗糖分解產(chǎn)生的果糖基轉(zhuǎn)移至乳糖還原性末端的C1羥基上從而合成低聚乳果糖的方法，目前應(yīng)用比較廣泛的是節(jié)桿菌產(chǎn)的β-呋喃果糖苷酶以及納豆芽孢桿菌產(chǎn)的果聚糖蔗糖酶（levansucrase）[14]。目前，國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)利用Bacillus flexus來(lái)源的果聚糖蔗糖酶生產(chǎn)低聚乳果糖的報(bào)道。本文主要針對(duì)前期構(gòu)建的一株重組短小芽孢桿菌進(jìn)行研究，摸索出不同條件對(duì)制備果聚糖蔗糖酶的影響，并對(duì)不同條件下其生產(chǎn)低聚乳果糖的能力進(jìn)行探索。

圖1 低聚乳果糖結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure chart of lactosucrose

1 材料與方法

1.1 菌株

帶有源自于彎曲芽孢桿菌Bacillus flexus果聚糖蔗糖酶基因lsc的重組短小芽孢桿菌B.brevis/pNCMO2-lsc為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基以及主要試劑

TM液體種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 10，多聚蛋白胨10，牛肉浸粉5，酵母粉2，微量元素液10 mL/L。其 中 微 量 元 素 液 組 成 為（g/L）：FeSO4·7H2O 1，MnSO4·4H2O 1，ZnSO4·7H2O 0.1。卡那霉素的終質(zhì)量濃度為 30 μg/mL。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：同種子培養(yǎng)基。

試劑：蛋白胨、酵母粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，新霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，α-乳糖、蔗糖等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)果聚糖蔗糖酶

將保存在-80℃冰箱中的菌種以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種至種子培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。然后，以體積分?jǐn)?shù)5%接種量轉(zhuǎn)接至已加入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)至48 h。將發(fā)酵液離心取上清，獲得重組酶的粗酶液。

1.4 酶活力測(cè)定方法

首先將粗酶液使用pH 7.0、濃度為20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋一定倍數(shù)，取1 mL已稀釋的酶液滴入1 mL 40 g/dL質(zhì)量濃度的蔗糖溶液并震蕩均勻，置于30℃水浴鍋中催化反應(yīng)20 min，最后煮沸30 min滅酶。反應(yīng)后的溶液經(jīng)適當(dāng)處理使用高效液相色譜測(cè)定酶活。采用Agilent 1200高效液相色譜儀，示差檢測(cè)器為安捷倫G1362A，色譜條件為流動(dòng)相：純水；流速：0.5 mL/min；色譜柱：Hi-Plex Ca 8 μm 300 mm×7.7；柱溫：80 ℃。

一個(gè)果聚糖蔗糖酶活力單位（U）定義：在pH 7.0，溫度30℃時(shí)每分鐘轉(zhuǎn)移1 μmol的葡萄糖所使用的酶量。

1.5 菌濃（OD600）的測(cè)定

取適量新鮮發(fā)酵液，稀釋至適宜濃度，使用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，OD600=稀釋倍數(shù)×OD600讀數(shù)?？瞻诪槿ルx子水所測(cè)得的OD600值。

1.6 單因素實(shí)驗(yàn)

分別使用不同的氮源、碳源和金屬離子作為唯一變量配制發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，其次研究不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，根據(jù)菌體生物量和果聚糖蔗糖酶產(chǎn)量分析最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

1.7 正交試驗(yàn)

選取4個(gè)因素分別為氮源（工業(yè)酵母粉∶棉籽粉=2∶1），碳源（葡萄糖∶蔗糖=1∶1），鈣離子和溫度，各取3個(gè)水平，其中碳源氮源皆為質(zhì)量比，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，研究最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

1.8 果聚糖蔗糖酶制備低聚乳果糖工藝優(yōu)化

1.8.1 加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響 在初始反應(yīng)溫度35℃，起始pH 7.0，蔗糖和乳糖質(zhì)量濃度均為200 g/L的情況下，加酶量分別控制為 0.5、1、2、3、4、5 U/g 底物， 設(shè)置水浴搖床溫度為30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，從第2小時(shí)開(kāi)始每隔2 h取樣煮沸終止反應(yīng)，直至反應(yīng)達(dá)到平衡。產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.2 溫度對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響 在起始pH 7.0，蔗糖和乳糖質(zhì)量濃度均為200 g/L的情況下，加酶量為2 U/g底物，轉(zhuǎn)速150 r/min，使反應(yīng)溫度分別為 25、30、35、40、45、50 ℃，在反應(yīng)進(jìn)行到 8 h時(shí)取樣煮沸終止反應(yīng)，直至反應(yīng)達(dá)到平衡。產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.3 pH對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響 在起始溫度為35℃時(shí)，蔗糖和乳糖質(zhì)量濃度均為200 g/L的情況下，加酶量為2 U/g底物，轉(zhuǎn)速150 r/min，使反應(yīng) pH 分別為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在反應(yīng)進(jìn)行到8 h時(shí)取樣煮沸終止反應(yīng)，直至反應(yīng)達(dá)到平衡。產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 低聚乳果糖測(cè)定方法以及產(chǎn)率的計(jì)算

1.9.1 低聚乳果糖測(cè)定方法 低聚乳果糖產(chǎn)物中的低聚乳果糖、蔗糖、乳糖以及單糖的量采用HPLC來(lái)確定。采用Agilent 1200高效液相色譜儀，示差檢測(cè)器為安捷倫G1362A，色譜條件為流動(dòng)相：純水；流速：0.5 mL/min； 色譜柱：Hi-Plex Ca 8 μm 300 mm×7.7；柱溫：80℃。采用外標(biāo)法，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積確定相應(yīng)低聚乳果糖的濃度。示差檢測(cè)確定樣品中低聚乳果糖等糖的峰面積，確定他們的含量并計(jì)算獲得轉(zhuǎn)化率。

1.9.2 低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

式（1）中，R為轉(zhuǎn)化率；m0為底物總質(zhì)量；m1為生成低聚乳果糖的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響

2.1.1 氮源種類(lèi)對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 由于B.brevis幾乎不利用無(wú)機(jī)氮源，使用無(wú)機(jī)氮源會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢以及酶產(chǎn)量很低[15]，故采用有機(jī)氮源來(lái)研究氮源對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響，以TM培養(yǎng)基為起始培養(yǎng)基，分別以17 g/L的工業(yè)酵母粉、工業(yè)蛋白胨、魚(yú)粉蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白、棉籽粉、多聚蛋白胨、玉米漿粉等取代TM中的氮源，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，采用工業(yè)酵母粉和棉籽粉時(shí)菌體生長(zhǎng)較旺盛且重組酶的產(chǎn)量也達(dá)到較大值，故使用工業(yè)酵母粉和棉籽粉作為復(fù)合氮源進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 不同氮源配比對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 將總氮源質(zhì)量濃度定為17 g/L，分別以工業(yè)酵母粉、棉籽粉、不同質(zhì)量配比的工業(yè)酵母粉與棉籽粉（1∶1、1∶2、2∶1） 作為唯一氮源在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。如圖3所示，在所用不同比例的工業(yè)酵母粉和棉籽粉的復(fù)合氮源時(shí)，以工業(yè)酵母粉∶棉籽粉質(zhì)量比例為2∶1時(shí)產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，且菌體生物量也較高。故選擇總氮源含量17 g/L，工業(yè)酵母粉與棉籽粉比例為2∶1的復(fù)合氮源做進(jìn)一步研究。

圖2 不同氮源對(duì)B.brevis生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of different nitrogen source on cell growth and enzyme production of B.brevis

圖3 不同氮源配比對(duì)B.brevis生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen proportion on cell growth and enzyme production of B.brevis

2.1.3 復(fù)配氮源質(zhì)量濃度對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 將工業(yè)酵母粉：棉籽粉比例定為2∶1，研究不同總氮源濃度（5、10、20、30、40 g/L）對(duì)果聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響（圖4），當(dāng)質(zhì)量濃度在5～30 g/L時(shí)，氮源濃度增加，生物量和酶活也上升，并在質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)酶活達(dá)到最大值。當(dāng)質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)酶活開(kāi)始減小。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能的原因是較高的氮源濃度會(huì)抑制重組酶的表達(dá)。因此，選擇30 g/L質(zhì)量濃度的工業(yè)酵母粉與棉籽粉質(zhì)量比例為2∶1的復(fù)合氮源做進(jìn)一步研究。

圖4 不同質(zhì)量濃度的復(fù)合氮源對(duì)B.brevis生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different nitrogen concentration on cell growth and enzyme production of B.brevis

2.2 碳源對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響

2.2.1 碳源種類(lèi)對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 以上述優(yōu)化好的復(fù)合氮源為唯一氮源，10 g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油、和糊精作為唯一的碳源配制培養(yǎng)基并于32℃下發(fā)酵產(chǎn)酶。由圖5可知，以蔗糖和葡萄糖為唯一碳源時(shí)，培養(yǎng)基中菌體的生物量最高，且對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)最明顯。故選用蔗糖和葡萄糖作為碳源做進(jìn)一步研究。

圖5 不同碳源對(duì)B.brevis生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of different carbon source on cell growth and enzyme production of B.brevis

2.2.2 碳源質(zhì)量濃度對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 選取單一碳源發(fā)酵中效果較好的蔗糖和葡萄糖進(jìn)行濃度和復(fù)配優(yōu)化。將種子液分別接種于5、10、20、30 g/L 葡萄糖，5、10、15、20 g/L 蔗糖以及10 g/L葡萄糖+10 g/L蔗糖的復(fù)配培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。如圖6所示，在10～30 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度和在10 g/L葡萄糖+10 g/L蔗糖的復(fù)配碳源中菌體的生物量都較高，而10 g/L葡萄糖+10 g/L蔗糖的復(fù)配碳源產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，考慮到實(shí)際應(yīng)用中的經(jīng)濟(jì)因素，故選擇20 g/L葡萄糖做進(jìn)一步研究。

圖6 不同葡萄糖和蔗糖質(zhì)量濃度以及配比對(duì)B.brevis生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of different concentration and proportion of sucrose and glucose on cell growth and enzyme production of B.brevis

2.3 金屬離子對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響

由于金屬離子是生理活性物質(zhì)的重要組成成分，且可以調(diào)節(jié)生理活性，因此它會(huì)對(duì)重組菌產(chǎn)果聚糖蔗糖酶產(chǎn)生較大的影響。一般在濃度較低時(shí)，這些金屬離子對(duì)菌的生長(zhǎng)和酶的表達(dá)具有促進(jìn)作用，相反，濃度較高時(shí)則表現(xiàn)出抑制作用。為了考察不同金屬離子對(duì)重組B.brevis外生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響，本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了終濃度為1 mmol/L的不同種類(lèi)的金屬離子取代TM中的金屬離子混合液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶。由圖7可知，Cu2+不僅不能提高酶活，反而使菌體生長(zhǎng)受到抑制，酶活更是受到嚴(yán)重抑制，而Mg2+、Co2+和Fe2+作為金屬離子添加劑時(shí)，菌體生長(zhǎng)也受到一定程度抑制，且酶活也受到一定程度的抑制；只有Ca2+不但可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，且酶活有較明顯的提高。而B(niǎo)ELGHITH等[16]的研究的芽孢桿菌研究表明Fe2+對(duì)酶活有較大的提高，可知微生物來(lái)源不同的果聚糖蔗糖酶受金屬離子的種類(lèi)和濃度的影響也不同。因此選擇Ca2+做進(jìn)一步研究。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響

溫度通常是間接的影響微生物的代謝活動(dòng)，但是其影響程度通常也較為明顯。在適宜的溫度范圍內(nèi)，微生物的代謝活動(dòng)會(huì)較為旺盛。為考察培養(yǎng)溫度對(duì)菌體的影響，接種后將發(fā)酵培養(yǎng)基置于23、25、27、30、33、37℃溫度下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。由圖8所示，溫度在23～33℃時(shí)，菌體量隨溫度的升高而增大，而酶活在27℃時(shí)果聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量達(dá)到最大值61.7 U/mL，27℃即為最適產(chǎn)酶溫度。

圖7 不同金屬離子對(duì)B.brevis生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of different metal ions on cell growth and enzyme production of B.brevis

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)B.brevis生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of temperature on cell growth and enzyme production of B.brevis

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶影響較大的4個(gè)因素氮源（工業(yè)酵母粉∶棉籽粉=2∶1），葡萄糖，鈣離子和溫度，各取 3 個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

由表2中正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中極差R值得出：4個(gè)因素對(duì)B.brevis產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響大小依次是A（氮源）＞D（葡萄糖）＞C（鈣離子）＞B（溫度），根據(jù)直觀(guān)分析得到最優(yōu)組合為A3B2C1D3。即氮源總質(zhì)量濃度為40 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L，鈣離子濃度為0.5 mmol/L，溫度為30℃，在此條件下酶活可達(dá)62.1 U/mL。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table2 Results and analyze of the orthogonal

2.6 果聚糖蔗糖酶制備低聚乳果糖的初步研究

2.6.1 加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響 酶轉(zhuǎn)化過(guò)程中加酶量不僅影響最終的低聚乳果糖產(chǎn)量，還會(huì)影響反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間。本研究在轉(zhuǎn)化過(guò)程中特定時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定反應(yīng)體系中低聚乳果糖的含量并繪制低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率變化的曲線(xiàn)。結(jié)果如圖9所示，加酶量為0.5 U/g底物時(shí)，前期反應(yīng)速率較低，反應(yīng)進(jìn)行10 h達(dá)到平衡，低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率為 31.89%。而加酶量為 1、2、3、4、5 U/g底物時(shí)，在2～6 h時(shí)，他們的轉(zhuǎn)化率比較接近，在24.41%～29.98%之間。在6 h之后，加酶量為3、4、5 U/g底物的樣品中，低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率緩慢增加，并接近平衡點(diǎn)，而加酶量為1、2 U/g底物的樣品在6 h之后低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率仍然繼續(xù)增加，在反應(yīng)進(jìn)行到8 h時(shí)可達(dá)到平衡。其中加酶量為2 U/g底物的樣品中低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到37%。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能是由于加酶量過(guò)低時(shí)導(dǎo)致其催化能力不足，酶反應(yīng)速率較低。而加酶量過(guò)高時(shí)，酶的水解活性大于其轉(zhuǎn)糖基活性，并且水解產(chǎn)物葡萄糖對(duì)低聚乳果糖的合成產(chǎn)生抑制作用，從而降低低聚乳果糖的最終轉(zhuǎn)化率。在對(duì)不同加酶量的產(chǎn)物檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)化率有下降的趨勢(shì)，此時(shí)可檢測(cè)到少量蔗果三糖的生成。因此，為了在盡可能短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化率，選用2 U/g底物的加酶量為最佳。

圖9 加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effect of enzyme concentration and reaction time on the yield of lactosucrose

2.6.2 溫度對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響 見(jiàn)圖10，在不同溫度下低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率差別較大。在35℃時(shí)，低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)到38.3%。在低于35℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而升高，溫度過(guò)低時(shí)，酶活會(huì)受到抑制。而溫度高于35℃之后，轉(zhuǎn)化率隨著溫度升高開(kāi)始下降，可能是由于溫度升高，有部分果聚糖蔗糖酶失活。故選擇最適反應(yīng)溫度為35℃。

圖10 溫度對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.10 Effect of temperature on the conversion rate of lactosucrose

2.6.3 pH對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響 pH會(huì)影響酶的生理活性從而影響到低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率。見(jiàn)圖11，在pH 6.0時(shí)低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率為39.1%，為不同pH情況下的最高值。此外，在pH 6.0～7.0這個(gè)范圍內(nèi)時(shí)，轉(zhuǎn)化率都維持在較高值。

圖11 pH對(duì)低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.11 Effect of pH on the conversion rate of lactosucrose

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，對(duì)重組菌產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其發(fā)酵產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)基為：氮源（工業(yè)酵母粉∶棉籽粉=2∶1，質(zhì)量比）為 40 g/L、葡萄糖為20 g/L、CaCl20.5 mmol/L，最適產(chǎn)酶溫度30℃。在最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，果聚糖蔗糖酶的酶活可達(dá)62.1 U/mL，是國(guó)內(nèi)外報(bào)道的最高水平。利用該重組果聚糖蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖-乳糖制備低聚乳果糖，在蔗糖和乳糖質(zhì)量濃度均為200 g/L情況下，確定其最適轉(zhuǎn)化條件：反應(yīng)溫度35℃，pH 6.0，加酶量為2 U/g底物，低聚乳果糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)39.1%，為國(guó)內(nèi)外報(bào)道的較高水平。