CBM融合位置對AuMan5A酶學性質的影響

袁風嬌，王春娟，李雪晴，李劍芳，鄔敏辰

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一類能夠水解甘露聚糖主鏈中β-1，4-D-甘露糖苷鍵的內切水解酶，屬于半纖維素酶類。大部分β-甘露聚糖酶由催化結構域和非催化結構域組成，碳水化合物結合結構域（Carbohydrate-binding module，CBM） 即為一種典型的非催化結構域，一般位于酶的N端或C端[1]。研究證明，CBM可促進酶識別特定底物或底物的某個區(qū)域，從而提高酶的催化效率并增強底物親和力，同時在提高酶穩(wěn)定性等方面有著重要作用。如今，融合酶技術作為一項具有廣泛應用前景的技術已在酶分子改造，提高酶活性、熱穩(wěn)定性、底物特異性等方面取得很大進展[2]。構建融合酶最簡單的方式就是通過連接肽將兩個或多個蛋白域首尾相連，從而獲得具有不同功能的融合酶。然而，ZHAO等[3]發(fā)現來自Clostridium stercorarium的木聚糖酶中有兩個不同家族的CBM結構分別位于其N端和C端，當除去其N端CBM時，突變酶的Topt降低10℃，而除去C端CBM時酶的穩(wěn)定性卻沒有明顯變化，因此認為該酶中主要是N端的CBM對其穩(wěn)定性起作用。JIN等[4]將Pectobacterium chrysanthemi的纖維素酶基因（Cel5Z：：Ω） 和Clostridium thermocellum的木聚糖酶基因（XynX）融合構建雙功能酶時發(fā)現，只有將Cel5Z整合到XynX的C末端時，融合酶才擁有雙功能酶活性。PHAM等[5]將Aspergillus niger Cellobiohydrolase B的CBM融合到Aspergillu terreusβ-甘露聚糖酶的C末端，結果表明重組Man-CBM的Km值降為0.9 mg/mL，明顯低于Man的Km值（1.3 mg/mL），且前者的熱穩(wěn)定性較后者也有明顯的提高。由此可見，構建融合酶時，CBM融合位置對其酶學性質有重要影響。

作者所在實驗室已成功克隆了一株來自Aspergillus usamiiYL-01-785家族的β-甘露聚糖酶基因Auman5A，在對該基因及其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析時發(fā)現，此基因編碼的β-甘露聚糖酶AuMan5A是一個不含CBM的單結構域蛋白[6]。BORASTON等[7]研究證明，來自Thermotoga maritima27家族的CBM可以特異性地結合甘露聚糖，并對酶的催化域具有熱保護作用。本研究將CBM27通過來源于Trichoderma reesei纖維二糖水解酶I的連接肽分別融合至AuMan5A的C末端及N末端，并成功將融合β-甘露聚糖基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A在畢赤酵母GS115中表達，分析CBM27融合前后以及不同融合位置對AuMan5A酶學性質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和培養(yǎng)基 表達質粒pPIC9K、E coliJM109、DH5α 和Pichia pastorisGS115 由作者所在實驗室保藏；克隆質粒pUCm-T，購自上海Sangon公司；重組質粒pUCm-T-Auman5A、pUCm-T-cbm27和pPIC9K-Auman5A，由本實驗室構建和保藏；LB、MD、YPD、YPD-G418、BMGY 和 BMMY 培養(yǎng)基的配制參照Multi-CopyPichiaExpression Kit（Invitrogen公司）操作手冊。

1.1.2 主要試劑 rTaq DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶，均購自大連TaKaRa公司；EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒、Geneticin G418、250 bp ladder marker和protein Marker，購自上海Sangon公司；角豆膠、D-甘露糖，Sigma公司產品；DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75，Amersham Pharmacia Biotech公司產品；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據Auman5A序列（GenBank：HQ839639）及連接肽（GenBank：GL985084） 與CBM27編碼基因序列，設計擴增融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A所需的8條PCR引物（表1），委托上海Sangon公司合成。

表1 擴增融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A的PCR引物Table1 PCR Primers for the amplification of fusion enzyme genes Auman5A-cbm27 and cbm27-Auman5A

1.2.2 重組表達質粒的構建 以pUCm-TAuman5A為模板，AC-F1、AC-R1為引物PCR獲得基因片段A1；以pUCm-T-cbm27為模板，TC-F1、TC-R1為引物PCR獲得基因片段C1；然后以A1和C1互為引物和模板第2輪重疊PCR初步合成Auman5A-cbm27基因，再加入引物AC-F1和TCR1，進行第3輪PCR擴增Auman5A-cbm27基因。同理，利用3輪重疊PCR，擴增合成cbm27-Auman5A基因。將純化的目的PCR產物與克隆質粒pUCm-T連接獲重組質粒pUCm-T-Auman5A-cbm27和pUCm-T-cbm27-Auman5A，轉化E.coliJM109，藍白斑篩選和DNA測序。將測序正確的重組質粒分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，割膠回收目的基因，與經同樣雙酶切的pPIC9K連接，獲得重組表達質粒pPIC9K-Auman5A-cbm27和pPIC9K-cbm27-Auman5A，轉化E.coliDH5α，DNA測序驗證。

1.2.3 β-甘露聚糖酶的表達和純化 分別將pPIC9K-Auman5A、pPIC9K-Auman5A-cbm27和pPIC9K-cbm27-Auman5A用SalⅠ線性化，電擊轉化畢赤酵母感受態(tài)細胞，具體操作參照基因脈沖儀（Bio-Rad公司）說明書。重組畢赤酵母的鑒定、多拷貝篩選和誘導表達等參照Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊。整合有空pPIC9K質粒的畢赤酵母GS115做空白對照。β-甘露聚糖酶的具體純化方法參照文獻[8]。SDS-PAGE分析重組表達產物，Bradford法[9]測定蛋白質含量。

1.2.4 β-甘露聚糖酶活性的測定 在20 mL具塞試管中加入2.4 mL 5 mg/mL角豆膠溶液（用pH 3.6、50 mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制），50 ℃保溫5 min；再加入0.1 mL適當稀釋的酶液，準確反應15 min；加入2.5 mL DNS試劑，在沸水浴顯色7 min，測定OD540值。在上述條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖（以D-甘露糖計）所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

1.2.5 β-甘露聚糖酶酶學性質分析

1）溫度對酶活性的影響：在不同溫度（50～80℃）下，按1.2.4方法測定酶活性。最適溫度Topt定義為最高酶活性（以相對酶活性100%計）所對應的溫度。將酶液用緩沖液適當稀釋后，分別置于45、50、55、60、65、70 ℃和 75 ℃下，保溫 1 h，測定不同溫度下樣品酶的活性。酶的熱穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上所對應的溫度范圍。

采用蛋白熱移位（PTS）法測定 AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的熔解溫度（melting temperature，Tm）。具體方法參見文獻[10]，并略作修改。按照PTS Kit操作手冊將蛋白質樣品和熒光染料混合，利用羅氏LightCycler 480Ⅱ實時定量PCR系統，在50～95℃溫度范圍內，以1℃/min的升溫速率，在激發(fā)和發(fā)射波長分別為533 nm和640 nm下檢測熒光信號，繪制熔解曲線；利用“Tm calling”分析方法獲得衍生熔解曲線，其峰值對應的溫度即為Tm值。

2）pH對酶活性的影響：用pH 2.5～6的緩沖液配制0.5%（質量體積比）角豆膠溶液，按1.2.4方法測定酶活性。最適pH定義為最高酶活性所對應的pH 值。將酶液在 pH 2～10.5、40℃處理 60 min，按1.2.4方法測定殘余酶活性。酶的pH穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上所對應的pH范圍。

3）β-甘露聚糖酶催化效率的測定：分別用pH 3.6、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制不同濃度（1.0～10 mg/mL）的角豆膠溶液，在酶各自的最適溫度下按1.2.4方法測定其酶活性。采用Origin 8.0軟件進行非線性擬合，計算酶的動力學常數kcat和Km及催化效率kcat/Km值。

1.3 統計學分析

實驗結果以±s表示，應用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒的構建

以pUCm-T-Auman5A為模板，經過第1輪PCR擴增，獲得長度約為1100 bp的基因片段A1（圖1泳道1）；以pUCm-T-cbm27為模板，經第2輪PCR擴增，獲得長度約為550 bp的基因片段C1（圖1泳道2）；經過第3輪PCR擴增，獲得長度約為1600 bp的Auman5A-cbm27（圖1泳道3）。同上，采用3輪PCR擴增分別獲得長度約為550 bp的 C2、1100 bp的 A2和 1600 bp的cbm27-Auman5A（圖1泳道4、5和6）。基因測序結果顯示融合基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A長度均為1610 bp（含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點），與預期一致。將它們分別克隆至pPIC9K，轉化E.coliDH5α。經上海Sangon公司測序，測序結果都包含1638 bp的目的基因和pPIC9K質粒上醇氧化酶基因AOX1約500 bp的序列，表明2種重組表達質粒pPIC9K-Auman5A-cbm27和pPIC9K-cbm27-Auman5A構建成功。

圖1 融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of two fusion mannanase gene，Auman5A-cbm27 and cbm27-Auman5A

2.2 重組β-甘露聚糖酶的表達和純化

挑選在YPD-G418（4.0 mg/mL）平板上長勢良好，分別整合有Auman5A、Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A的畢赤酵母單菌落轉化子，按Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊進行常規(guī)誘導表達，分別篩選得到3個產酶活性最高的重組子 GS115/Auman5A、GS115/Auman5A-cbm27和GS115/cbm27-Auman5A（圖 2泳道 1～3）， 按 1.2.4方法測定粗酶液的酶活性分別為33.8、43.2、21.7 U/mL，而在空白對照GS115/pPIC9K上清液中未檢測到β-甘露聚糖酶活性。

圖2 表達上清液和純化酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE Analysis of the expressed supernatants and purified mannanases

分別通過（NH4）2SO4沉淀、陰離子交換層析、超濾及凝膠過濾層析將篩選得到的3個菌株誘導得到的培養(yǎng)上清液進行純化，并對純化后的樣品進行SDS-PAGE分析。純化后的reAuMan5A、reAuMan5A-CBM27和CBM27-reAuMan5A分別在約 49.8×103、60.2×103、60.2×103（表觀分子量） 顯示出單一條帶（圖2泳道4～6）。按1.2.3方法測得純化后的3個酶的比酶活分別為230.6、280.3、281.1 U/mg。

2.3 重組β-甘露聚糖酶酶學性質分析與討論

2.3.1 溫度對甘露聚糖酶活性的影響 按1.2.5方法分別測定了溫度對AuMan5A、AuMan5A-CBM27、CBM27-AuMan5A 活性的影響（圖3）。由圖3（a）可見，AuMan5A、AuMan5A-CBM27 的Topt均為 70℃，而CBM27-AuMan5A的Topt較AuMan5A降低了約10℃。由圖 3（b）可見，AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A分別在68℃和58℃及以下保持穩(wěn)定，較AuMan5A分別提高了8℃和降低了2℃。結果表明：當CBM27融合在AuMan5A的C末端時才對酶的催化中心發(fā)揮出熱保護作用。然而，XU等[11]將來自Thermotoga marimitaGH10家族耐熱的木聚糖酶C端的CBM2融合至來自Aspergillus nigerGH11家族木聚糖酶的N端時發(fā)現，融合酶的Topt提高了2℃，催化效率提高了4.5倍。因此，有研究者認為CBM及其融合位置對于酶穩(wěn)定性的影響還存在爭議，酶的熱穩(wěn)定性除了與CBM有關外，還與其本身的氨基酸序列有關，當CBM位于酶特定的位置時，會與其本身的氨基酸形成氫鍵等相互關系，從而使酶的穩(wěn)定性提高。因此，CBM對酶分子穩(wěn)定性提高的機制還有待于進一步研究。

圖3 溫度對3種重組β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.3 Effects of temperature on the activities of three recombinant β-mannanases

熔解溫度Tm表示在溫度上升過程中蛋白質三維結構發(fā)生解折疊到一半時對應的溫度，Tm值越高，蛋白質熱穩(wěn)定性越高，因此Tm值是評價蛋白質耐熱性的重要參數[12]。由圖4可知，AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的Tm值分別為66.5、74.2、61.3℃，與酶的熱穩(wěn)定性數據基本保持一致。

圖 4 AuMan5A、AuMan5A-CBM27 和 CBM27-AuMan5A的熱變性曲線Fig.4 Thermaldenaturation curvesofAuMan5A、AuMan5A-CBM27 and CBM27-AuMan5A

2.3.2 pH對甘露聚糖酶活性的影響 按1.2.5方法分別測定了pH對AuMan5A、AuMan5A-CBM27、CBM27-AuMan5A 活性的影響（圖5）。由圖5（a）可見，野生型酶和融合酶的最適pH均為4.0，AuMan5A在pH值2.5～7.5范圍內保持穩(wěn)定（圖5（b））。而 AuMan5A-CBM27、CBM27-AuMan5A 均在pH 2.0～9.0范圍內具有較好的穩(wěn)定性。由此可見，將CBM27融合至C或N末端均拓寬了AuMan5A的反應pH值范圍。

2.3.3 酶動力學常數分析 按1.2.5方法測定了3種β-甘露聚糖酶水解角豆膠的動力學常數Km和kcat（表 2）。分析結果表明 AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的催化效率（kcat/Km）較AuMan5A均有不同程度的提高，但AuMan5A-CBM27的催化效率最高。因此，不論CBM27融合至AuMan5A的C末端或N末端都可以提高β-甘露聚糖酶的催化效率，當位于C末端時催化效率的提高幅度更大。研究證明，CBM27可以特異性地結合甘露聚糖，并對酶的催化結構域起熱保護作用，且大部分CBM都具有結合纖維晶體的表面，并通過與帶電氨基酸間形成的氫鍵網絡，以及催化結構域堆積作用與不溶性底物結合，從而增強底物親和力和催化效率[6]。

圖 5 pH對3種β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.5 Effects of pH on the activities of three β-mannanases

表2 3種β-甘露聚糖對底物的動力學參數Table2 Kinetic parameters of three β-mannanases

3 結語

基于融合蛋白設計的融合酶技術是分子酶工程的一個研究熱點，已逐漸應用于多功能酶的構建與應用[13]，并顯示出重要的理論和應用研究價值。本實驗成功構建了融合β-甘露聚糖酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A，并在畢赤酵母GS115中實現表達。通過研究發(fā)現融合酶與親本酶在酶學性質和動力學常數等方面的差別表明，CBM27融合位置的變化，對融合酶的酶學性質有顯著的影響。實驗結果證明，重組融合酶reAuMan5ACBM27具有熱穩(wěn)定性高、pH穩(wěn)定范圍廣、底物親和力強和催化效率高等優(yōu)點，在工業(yè)化生產中有著巨大的應用潛力。本實驗對CBM融合位置對酶功能的影響的研究為其他融合酶基因的開發(fā)和應用提供了新的思路和策略。