硫化物對(duì)黑臭河道底泥反硝化潛勢(shì)的影響作用研究

汪珊 朱瑾 何巖 黃民生 周運(yùn)昌

摘要：通過探究不同濃度硫化物對(duì)黑臭河道底泥反硝化過程的影響，同時(shí)分析底泥細(xì)菌、反硝化菌和硫酸鹽還原菌的響應(yīng)變化，為強(qiáng)化底泥反硝化脫氮提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐.研究結(jié)果表明：較低濃度的硫化物（8 mg.L^-1）對(duì)底泥反硝化潛勢(shì)無(wú)明顯影響;適宜濃度的硫化物（40和64 mg.L^-1）對(duì)底泥反硝化有明顯的促進(jìn)作用，且濃度越高促進(jìn)作用越明顯;當(dāng)硫化物濃度升高到96 mg.L^-1及以上時(shí)，還原態(tài)硫?qū)Ψ聪趸^程起抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯.底泥經(jīng)過一段時(shí)間的反硝化培養(yǎng)，細(xì)菌多樣性以變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門為主;同時(shí)，底泥細(xì)菌總數(shù)明顯增加，代謝菌群的nirS豐度比、dsrB豐度比分別為1.42%和0.05%，相較原始底泥（0.15%，0.19%），反硝化細(xì)菌增值明顯，但硫酸鹽還原菌數(shù)量有所下降.

關(guān)鍵詞：黑臭河道;還原態(tài)硫;反硝化;底泥

中圖分類號(hào)：X522

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2019.04.015

0 引言

隨著黑臭河道整治工作的相繼開展，河道黑臭現(xiàn)象得到了有效控制，但總氮去除率偏低問題逐漸凸顯，氮營(yíng)養(yǎng)鹽難以去除成為黑臭河道治理過程中亟待解決的突出問題.硫元素是河道生態(tài)系統(tǒng)的重要元素，由于水體中硫化物的高度不穩(wěn)定性，其對(duì)氮素削減過程的影響作用往往被屏蔽.此外，現(xiàn)階段關(guān)于硫?qū)Ψ聪趸饔玫难芯窟€存在分歧.一方面，硫化物可能耦合硝酸鹽還原過程，促進(jìn)硫自養(yǎng)反硝化的發(fā)生[1-2]：另一方面，高濃度的硫化物會(huì)通過抑制一氧化氮（NO）和一氧化二氮（N20）還原酶的活性來阻礙反硝化過程的進(jìn)行[3-4]，但尚不明確還原態(tài)硫?qū)Ψ聪趸绊懽饔玫臐舛认拗?因此，探究硫化物對(duì)黑臭河道底泥反硝化潛勢(shì)的影響機(jī)制可為強(qiáng)化底泥反硝化脫氮提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本實(shí)驗(yàn)所需的河道底泥和上覆水均采集于上海市桃浦區(qū)里店浦，該河為上海市工業(yè)河的一條支流，受沿岸排污口影響不斷納入污水，污染情況嚴(yán)重，河水的水動(dòng)力條件較差，自凈能力較弱，是典型的城市黑臭河道.采樣河道的位置如下圖1所示，

里店浦底泥的基本理化性質(zhì)：底泥酸可揮發(fā)硫化物（AVS）含量為122.7 μmol.g^-1，底泥總鐵含量為19.7 9.kg^-1.

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

將取回的底泥置于500 mL血清瓶中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液和微量元素溶液[11]，河道底泥與液體培養(yǎng)基比例為1：10，添加相應(yīng)濃度的硫化物（Na2S.9H20，分析純）和硝酸鹽氮（KN03，分析純），密封遮光處理后置于30。C恒溫箱中培養(yǎng).

為探究不同硫化物濃度對(duì)自養(yǎng)反硝化的影響，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組1 5（見表1），分別設(shè)置硫化物溶液為0、8、40、64和96 mg.L.1進(jìn)行反硝化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（此前預(yù)實(shí)驗(yàn)已知8和40mg.L.1對(duì)反硝化有促進(jìn)作用，96 mg.L^-1起抑制作用）.

在培養(yǎng)期間，定期取樣測(cè)定NH4-N、N02 -N、N03-N、S2-和S02-的濃度.每當(dāng)測(cè)定的S2-和N02 -N濃度低于檢測(cè)限時(shí)，更換培養(yǎng)液，同時(shí)向血清瓶中添加相應(yīng)基質(zhì).

1.3 高通量測(cè)序及熒光定量PCR的測(cè)定

硫自養(yǎng)反硝化實(shí)驗(yàn)各組趨于穩(wěn)定時(shí)，將根據(jù)理化指標(biāo)分析，選取關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組中的底泥進(jìn)行細(xì)菌通用引物和基于功能基因16S rDNA、nirS、dsrB的高通量測(cè)序分析及熒光定量PCR測(cè)定分析，以解析底泥細(xì)菌、反硝化和硫酸鹽還原菌群豐度及結(jié)構(gòu)的響應(yīng)變化.高通量測(cè)序與熒光定量測(cè)定所用引物如下表2所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 硫化物濃度對(duì)底泥反硝化作用的影響

不同硫化物濃度對(duì)反硝化過程的影響不同.圖2是比較各實(shí)驗(yàn)組硝酸鹽的濃度變化，從圖上直線的下降水平可以看出，硫化物濃度為8 mg.L^-1、40 mg.L^-1和64 mg.L^-1的實(shí)驗(yàn)組硝酸鹽還原速率高于不加硫化物的空白對(duì)照組，并且硫化物濃度為64 mg.L^-1的實(shí)驗(yàn)組硝酸鹽還原速率最快，其次是40 mg.L^-1和8 mg.L^-1，即硫化物濃度越高，硝酸鹽還原速率越快，且底泥培養(yǎng)體系在10～14 d內(nèi)硝酸鹽的還原率均可達(dá)到98%以上.相比不添加硫化物的培養(yǎng)組（對(duì)照組），8 mg.L^-1的硫化物對(duì)反硝化促進(jìn)作用不明顯;40 mg.L^-1的硫化物對(duì)反硝化有促進(jìn)作用但在第3個(gè)培養(yǎng)周期后才顯現(xiàn)出，平均每個(gè)培養(yǎng)周期的第6天硝酸鹽還原率即可達(dá)到98%以上;64 mg.L^-1的硫化物對(duì)反硝化有明顯的促進(jìn)作用且平均每個(gè)培養(yǎng)周期的第3天硝酸鹽還原率即可達(dá)到98%以上（見表3）.實(shí)驗(yàn)組5硫化物濃度為96 mg.L^-1，硝酸鹽的還原速率明顯低于空白組，反硝化過程一直被抑制，一個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)反應(yīng)體系內(nèi)硝酸鹽的濃度約為（6.62±0.03）mg.L-1，抑制率約為23.64%;實(shí)驗(yàn)組2后期硫化物濃度升高至160 mg.L^-1（從第6個(gè)培養(yǎng)周期開始），硝酸鹽的還原速率明顯降低，同時(shí)一個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)反應(yīng)體系內(nèi)硝酸鹽的濃度約為（9.52±0.22）mg.L^-1，第6～8個(gè)培養(yǎng)周期硝酸鹽還原抑制率約為34%.

由此可見，較低濃度的硫化物（S2-濃度不高于64 mg.L^-1）對(duì)反硝化過程起一定的促進(jìn)作用，且濃度越高促進(jìn)作用越明顯，推測(cè)可能出現(xiàn)了硫自養(yǎng)反硝化的發(fā)生[7] S2-作為電子供體加速硝酸鹽的還原過程：而高濃度硫化物對(duì)底泥的反硝化過程有抑制作用，其原因主要是硫化物對(duì)一氧化氮（NO）和一氧化二氮（N20）還原酶的活性有抑制從而阻礙的反硝化進(jìn)程[6].

此外，高濃度硫化物實(shí)驗(yàn)組后期出現(xiàn)較明顯的氨氮積累（見圖3）.S2-濃度為96 mg.L^-1和160 mg.L^-1的底泥培養(yǎng)組氨氮濃度明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，氨氮積累濃度分別為（3.94±0.16）mg.L^-1和（4.46±0.14）mg.L^-1，同時(shí)亞硝氮積累濃度分別為（4.02±0.15）mg.L^-1和（2.82±0.13）mg.L^-1，但積累的亞硝氮會(huì)在每個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)消耗完畢，推測(cè)實(shí)驗(yàn)中可能存在異化硝酸鹽還原過程（Dissimilatory nitrate reduction to ammoumum，DNRA），硫化物濃度較高會(huì)抑制反硝化并作為電子供體參與呼吸型DNRA過程[8].

不同硫化物濃度下各實(shí)驗(yàn)組硫化物和硫酸鹽濃度變化有明顯差異（見圖3）.當(dāng)S2-濃度小于或等于64 mg.L^-1時(shí)，一個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)硫酸鹽SO4一的平均濃度隨所添加硫化物濃度的增加而升高.S2-濃度為40 mg.L^-1和64 mg.L^-1時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)SO4一濃度分別為（241.5±2.6）mg.L^-1和（306.5土4.4）mg.L^-1.S2一濃度升高至96 mg.L^-1和160 mg.L^-1，硫酸鹽濃度卻沒有升高，推測(cè)其原因可能是高濃度硫化物未能促使硫自養(yǎng)反硝化的發(fā)生，部分還原態(tài)的硫未能通過該反應(yīng)生成硫酸鹽并積累.

2.2 硫影響底泥反硝化過程的關(guān)鍵菌群群落結(jié)構(gòu)及豐度響應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)組3（硫化物濃度為40 mg.L^-1，硝酸鹽28 mg.L^-1）、原始底泥、對(duì)照組（未添加硝酸鹽，硫化物濃度為40 mg.L^-1）來進(jìn)行高通量及熒光定量PCR分析，實(shí)驗(yàn)組3是按硫自養(yǎng)反硝化計(jì)量比添加的硫化物濃度，上覆水實(shí)驗(yàn)也測(cè)得該組反硝化作用得到顯著促進(jìn)，而對(duì)照組是為了排除硫化物本身對(duì)微生物的影響，對(duì)比可得硫自養(yǎng)反硝化作用過程中微生物群落特點(diǎn).

借助于高通量及熒光定量PCR探究底泥培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組3的底泥中與氮硫代謝相關(guān)微生物的豐度與結(jié)構(gòu)響應(yīng)變化，以期望進(jìn)一步解析硫?qū)Φ啄喾聪趸瘽摿Φ挠绊?

2.2.1 底泥氮硫代謝相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)的響應(yīng)變化

培養(yǎng)組底泥細(xì)菌多樣性與對(duì)照組有明顯差異（見表4）.實(shí)驗(yàn)組3（硫化物40 mg.L^-1）細(xì)菌的OTU數(shù)、Chaol、Shannon和Simpson指數(shù)均低于對(duì)照培養(yǎng)組（硫化物40 mg.L^-1，未添加硝酸鹽）.原因可能是實(shí)驗(yàn)組發(fā)生反硝化作用，微生物以自養(yǎng)細(xì)菌為主，而自養(yǎng)細(xì)菌世代周期較長(zhǎng)、增殖較慢，因此豐富度偏低.

根據(jù)底泥結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果（見圖4），反硝化培養(yǎng)組底泥細(xì)菌多樣性以變形菌門（Proteobac-teria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和嗜熱絲菌門（Caldiserica）為主;對(duì)照組底泥細(xì)菌以變形菌門（Proteobacte-ria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主.變形菌門（Proteobacteria）在實(shí)驗(yàn)組3和對(duì)照培養(yǎng)組底泥中的相對(duì)豐度分別為53.75%和28.31%;綠彎菌門（Chloroflexi）在各培養(yǎng)組底泥中的相對(duì)豐度分別為22.96%和37.45%;擬桿菌門（Bacteroidetes）在各培養(yǎng)組底泥中的相對(duì)豐度為13.21%和21.61%（見表5）.在為期近100 d的培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組3底泥的變形菌門（Proteobacteria）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照培養(yǎng)組底泥，分析可能是長(zhǎng)時(shí)間反硝化潛力的培養(yǎng)使得底泥反硝化細(xì)菌（隸屬于變形菌門）活性提高且數(shù)量增加，而對(duì)照培養(yǎng)組培養(yǎng)過程中只添加了硫化物，沒有硝酸鹽作為電子受體供反硝化細(xì)菌利用，因此其反硝化細(xì)菌的活性相對(duì)較低.

基于功能基因nirS檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組3底泥的優(yōu)勢(shì)硫自養(yǎng)反硝化菌為硫桿菌屬（Thiobacillus）與硫針菌屬（Sulfuritalea）分別占21.5%與4.85%.對(duì)照培養(yǎng)組優(yōu)勢(shì)硫自養(yǎng)反硝化菌為硫桿菌屬（Thiobacillus）與硫針菌屬（Sulfuritalea），分別占2.43%和0.805.硫桿菌屬（Thiobacillus）是最常見且研究最為廣泛的硫自養(yǎng)反硝化菌[27].實(shí)驗(yàn)組3底泥中的硫桿菌屬（ Thiobacillus）的相對(duì)豐度（21.5%）遠(yuǎn)高于對(duì)照培養(yǎng)組，表明該體系中硫自養(yǎng)反硝化活性很高，與促進(jìn)反硝化作用分析一致.另外，帕氏氫噬胞菌（llydrogenophaga）和苯基桿菌屬（Phenylobacterium）在該培養(yǎng)組中相對(duì)豐度較高，上述菌屬的主要功能分別是多環(huán)芳烴的降解和石油烴及一些混合烴的降解，推測(cè)是培養(yǎng)組中反硝化菌為自養(yǎng)細(xì)菌，為其他降解有機(jī)物的細(xì)菌提供了更適宜的生成空間.對(duì)于反硝化細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)組3底泥中主要的反硝化細(xì)菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）與陶厄氏菌屬（Thauera）分別占1.78%與14.3%;在只添加硫化物的對(duì)照培養(yǎng)組底泥中分別占2.38%和14.6%.實(shí)驗(yàn)組底泥的核心反硝化菌屬為陶厄氏菌屬（Thauera）、假單胞菌（Pseudomonas）、貪銅菌屬（Cupriavidus）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）和副球菌（Paracoccus）.

基于功能基因dsrB分析底泥硫酸鹽還原菌可知：實(shí)驗(yàn)組3底泥中的硫酸鹽還原菌主要為脫硫微菌屬（Desulfomicrobium）與脫硫腸狀菌屬（Desulfotomaculum），分別占0.56%與15.3%;在只添加硫化物的對(duì)照培養(yǎng)組底泥中分別占1.18%和5.65%.可以看出實(shí)驗(yàn)組脫硫腸狀菌屬含量明顯小于對(duì)照培養(yǎng)組，推測(cè)可能實(shí)驗(yàn)組反硝化作用得到促進(jìn)，反硝化細(xì)菌與硫酸鹽還原菌競(jìng)爭(zhēng)激烈，不利于硫酸鹽還原，導(dǎo)致該菌屬含量明顯下降.

2.2.2 底泥氮硫代謝相關(guān)菌群豐度的響應(yīng)變化

在為期近100 d的培養(yǎng)后，底泥細(xì)菌總數(shù)明顯增加.實(shí)驗(yàn)組3中的細(xì)菌數(shù)量由初始的1.06x109 copies/g dry sediment增加至2.6lx109copies/g dry sediment，底泥細(xì)菌數(shù)量較培養(yǎng)之前的細(xì)菌數(shù)增加了約1.5倍.表明對(duì)河道底泥較長(zhǎng)時(shí)間反硝化潛力的培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)體系底泥中細(xì)菌的增殖，細(xì)菌數(shù)量有大幅度增加，活性也響應(yīng)會(huì)有大幅度增加.

培養(yǎng)后的底泥反硝化細(xì)菌數(shù)量明顯增加，而硫酸鹽還原菌數(shù)量有所下降，實(shí)驗(yàn)組3中的反硝化細(xì)菌數(shù)量由初始的1.58x10⁶copies/g dry sediment增加至3.7lx107copies/g dry sediment，底泥反硝化細(xì)菌數(shù)量較培養(yǎng)之前的反硝化細(xì)菌數(shù)增加了約22倍.硫酸鹽還原細(xì)菌數(shù)量由初始的1.99x10⁶copies/g dry sediment降至1.32x10⁶copies/g dry sediment.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表6）也可得實(shí)驗(yàn)組3底泥代謝菌群與原始底泥的nirS豐度比、dsrB豐度比，相比之下可以看出，底泥在40 mg.L^-1硫化物的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，nirS豐度比明顯上升，而dsrB豐度比則有一定程度下降.上述現(xiàn)象均表明添加40 mg.L^-1硫化物培養(yǎng)，有利于硝化細(xì)菌的增值，而硫酸鹽還原菌的增值受到抑制.硫酸鹽還原菌與硝酸鹽還原菌共同競(jìng)爭(zhēng)為電子供體，存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，硝酸鹽還原菌的增值可能一定程度上抑制硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致數(shù)量下降.周期性地向培養(yǎng)體系內(nèi)添加硫化物與硝酸鹽，有利于硫自養(yǎng)反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)與富集.

3 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)探究了硫化物對(duì)黑臭河道底泥反硝化作用潛勢(shì).當(dāng)硫化物濃度控制在64 mg.L^-1以下時(shí)，還原態(tài)的硫會(huì)對(duì)反硝化過程起促進(jìn)作用，硝酸鹽還原率可達(dá)98%以上，且S2-濃度越高硝酸鹽還原速率越快，反硝化過程越短.當(dāng)還原硫濃度升高到96 mg.L^-1及以上時(shí)，還原態(tài)硫?qū)Ψ聪趸^程起抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯.同時(shí)，添加適宜濃度的硫化物（40 mg.L^-1）培養(yǎng)一段時(shí)間，細(xì)菌總數(shù)明顯增加，尤其是反硝化細(xì)菌的增加量達(dá)到原來的22倍，同時(shí)一定程度上抑制了硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，總體上細(xì)菌總數(shù)增加，對(duì)反硝化過程起促進(jìn)作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)硫化物濃度控制在64 mg.L^-1以下會(huì)對(duì)反硝化作用起促進(jìn)作用，濃度高于96 mg.L^-1對(duì)反硝化起抑制作用，但是64～96 mg.L^-1之間相應(yīng)情況未知，需要進(jìn)一步設(shè)置濃度梯度，探究最佳促進(jìn)濃度和抑制限值，從而更有效地進(jìn)行硫自養(yǎng)反硝化，提高脫氮除硫效率，為黑臭河道治理工程提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐，緩解城市黑臭河道現(xiàn)象.

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