成年大鼠心室和竇房結(jié)細(xì)胞急性分離方法和動作電位比較

范 茁

成年大鼠心室和竇房結(jié)細(xì)胞急性分離方法和動作電位比較

范 茁

（華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006）

介紹了急性分離成年大鼠心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞的方法。通過全細(xì)胞膜片鉗實驗技術(shù)分別檢測了竇房結(jié)細(xì)胞的自發(fā)動作電位和心室肌細(xì)胞的誘發(fā)動作電位，比較了二者動作電位波形在形態(tài)上的差異，并通過計算比較了心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞動作電位時程和靜息電位水平，分析了二者電生理特性差異形成的原因。

心室肌細(xì)胞；竇房結(jié)細(xì)胞；動作電位；動作電位時程；靜息電位

心臟是人及動物重要的供血器官，它靠有規(guī)律的博動向周圍器官和組織運輸新鮮血液，供應(yīng)氧氣和各種養(yǎng)分，使其維持正常的代謝功能[1]。心臟規(guī)律性搏動的本質(zhì)是動作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)引起的心肌細(xì)胞的擴(kuò)布性舒縮[2-3]。竇房結(jié)（sinoatrial node，SAN）位于上腔靜脈和右心房交界處的界溝上端，其作為心臟的起搏點，控制心臟正常的節(jié)律性活動，竇房結(jié)的起搏細(xì)胞（P細(xì)胞）產(chǎn)生自發(fā)興奮性動作電位，并將沖動傳至新房肌細(xì)胞、房室結(jié)，進(jìn)而由房室束傳至心室肌細(xì)胞，引起心室收縮[4-6]。在細(xì)胞水平研究心臟生理及病理條件下的功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及藥物作用機(jī)制在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用領(lǐng)域都有很重要的作用。酶解法是獲得成年大鼠心肌細(xì)胞的主要方法[7-9]，膜片鉗實驗方法則是研究心肌細(xì)胞電生理的主要技術(shù)手段[10-12]。

本文介紹成年大鼠心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞的急性酶解分離方法，通過膜片鉗技術(shù)手段記錄二者的動作電位波形，并對二者動作電位形態(tài)、時程、靜息電位等參數(shù)進(jìn)行分析和比較。

1 溶液配置

（1）臺式液（Tyrode, in mM）：NaCl(120), KCl(5.4), HEPES(25), MgCl2(0.5), NaH2PO4(0.33), Taurine(10), Glucose(20). 室溫調(diào)節(jié)PH值至7.2。

（2）KB液（in mM）：KOH(80), KCl(40), NaH2PO4(25), MgSO4(3), L-glutanic acid(50), Taurine(20), EGTA(1), HEPES(10), Glucose(10). 室溫調(diào)節(jié)PH值至7.2。

（3）電生理實驗內(nèi)液（in mM）：KCl (130), NaCl (10), MgCl2.6H2O(5), HEPES(10), EGTA(0.5), Mg- ATP(5). 室溫調(diào)節(jié)pH值至7.2。

（4）電生理實驗外液(HBSS, Sigma; in mM): CaCl2(1.3), MgSO4(0.8), KCl(5.4), KH2PO4(0.4), NaCl(136.9), Na2HPO4(0.3), D-glucose(10) and NaHCO3(4.2). 室溫調(diào)節(jié)pH值至7.2。

2 實驗方法

2.1 成年大鼠心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞的急性分離

2.1.1 成年大鼠心室肌細(xì)胞的急性分離

成年SD大鼠（250 g左右，雌雄不限）經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）、肝素(250 U/kg)后，用75%的酒精消毒胸部皮膚，剪開胸腔并迅速取下心臟，放入預(yù)冷無鈣臺式液中，輕輕擠壓出血液，然后將心臟主動脈插于langendorff灌注裝置上，用動脈夾固定位置，并用縫合線扎緊主動脈。按以下步驟對心肌細(xì)胞進(jìn)行酶解分離（灌流液溫度控制在37 ℃）：首先用無鈣臺式液灌流沖洗3~5 min，同時用鑷子輕輕擠壓心臟排出血液，至流出液變澄清；改用充氧的酶I（Tyrode + 0.8 g/L II膠原酶+1.0 g/L牛血清白蛋白+50 μM CaCl2）灌流消化2 min；然后用含蛋白酶的酶II灌流消化（Tyrode + 0.8 g/L II型膠原酶 + 0.1 g/L蛋白酶 + 1.0 g/L牛血清白蛋白，200 μM CaCl2），棄掉前2 min流出液；然后循環(huán)灌流消化，待心臟軟塌時剪下心室，并在酶III（Tyrode + 0.8 g/L II型膠原酶 + 1.0 g/L牛血清白蛋白 + 600 μM CaCl2）中剪碎，振蕩消化 3 min，200目金屬網(wǎng)篩過濾后于500 r/min離心1 min，棄上清；然后將細(xì)胞懸浮于含1 mmol/L鈣離子的臺式液中（Tyrode + 1.0 g/L牛血清白蛋白 + 1 mmol/L CaCl2），靜置10 min，棄去上清，用M199培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱備用。

2.1.2 成年大鼠竇房結(jié)細(xì)胞的急性分離

按分離心室肌細(xì)胞同樣的方法，將成年大鼠麻醉、消毒并取出心臟，然后在35 ℃含肝素（10 U/mL）的臺式液中進(jìn)一步分離出竇房結(jié)組織；之后將竇房結(jié)組織在含II型膠原酶（0.8 g/L）、蛋白酶（0.1 g/L）和彈性蛋白酶（0.1 g/L）的臺式液中消化分離25~30 min；消化完后將竇房結(jié)組織轉(zhuǎn)入35 ℃ KB液中，用玻璃吸管輕輕吹打分離細(xì)胞；梯度復(fù)鈣后放入培養(yǎng)箱待用。

2.2 電生理實驗

電生理動作電位記錄采用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式，信號放大器為HEKA系統(tǒng)EPC-9，采集軟件為PatchMaster，采樣頻率為10 kHz和濾過頻率為2.9 kHz。心室肌細(xì)胞動作電位需要由幅度為800 pA、時長為 5 ms的脈沖電流誘發(fā)，竇房結(jié)細(xì)胞則為自發(fā)動作電位，無需脈沖電流誘發(fā)。動作電位時長用APD50表示，即動作電位幅度復(fù)極一半時的時長。

數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計使用的軟件為Origin 8.0，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，統(tǒng)計結(jié)果采用Mean + SEM的方式表示。< 0.01表示具有極顯著性差異，用**表示。

3 結(jié)果和討論

3.1 心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖1是急性分離的大鼠心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察的圖像，左邊為心室肌細(xì)胞，右邊為竇房結(jié)細(xì)胞。由圖1可見，心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞在形態(tài)上有明顯差異，心室肌細(xì)胞呈長桿狀，輪廓清晰，細(xì)胞表面條紋清晰可見；竇房結(jié)細(xì)胞則呈梭形，兩頭尖細(xì)中間較圓，且無明顯橫條紋。

圖1 急性分離的心室肌細(xì)胞（Ventricular）和竇房結(jié)細(xì)胞（SAN）

3.2 心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞動作電位比較

采用膜片鉗電流鉗模式分別記錄了心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞的動作電位，結(jié)果見圖2。圖2(a)為心室肌細(xì)胞動作電位，由800 pA、5 ms脈沖電流誘發(fā)，在動作電位上升初期能看到刺激偽跡（stimulus artifact，SA），圖2(b)為竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)動作電位，為一長串自發(fā)動作電位圖形中截取的單個動作電位波形。二者在形態(tài)上存在如下差異：

（1）心室肌細(xì)胞受電流刺激后，動作電位迅速上升，很短時間達(dá)到峰值，而竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)動作電位上升緩慢，二者上升速率分別為（3.99 ± 0.81）V/s和（0.20 ± 0.01）V/s，差異顯著（<0.01）；

（2）復(fù)極化過程心室肌細(xì)胞有明顯的平臺期，竇房結(jié)細(xì)胞則沒有明顯平臺期，竇房結(jié)細(xì)胞復(fù)極化過程相對心室肌細(xì)胞較快；

（3）心室肌細(xì)胞在刺激之前及復(fù)極化后能長時間保持靜息化水平，竇房結(jié)細(xì)胞復(fù)極后迅速進(jìn)入下一個自發(fā)動作電位過程（圖2(c)）。

心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞的動作電位時程和靜息電位值比較見圖3。心室肌細(xì)胞動作電位時程比竇房結(jié)細(xì)胞長，二者APD50值分別為（298.91±41.96）ms和（171.75±3.78）ms，有顯著性差異（<0.01）。心室肌細(xì)胞靜息電位水平相對竇房結(jié)細(xì)胞較低，二者分別為（-66.83 ± 2.38）mV和（-51.06 ± 1.31）mV，存在顯著差異（<0.01）。

圖2 心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞動作電位比較

圖3 心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞動作電位時程和靜息電位比較

4 結(jié)論

本文檢測表明：心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞在形態(tài)上存在明顯差異，心室肌細(xì)胞呈現(xiàn)長桿形狀，而竇房結(jié)細(xì)胞則呈梭形；心室肌細(xì)胞表面有明顯橫紋，竇房結(jié)細(xì)胞表面光滑，無明顯條紋。二者電生理特性也存在顯著差異，表現(xiàn)在竇房結(jié)細(xì)胞有連續(xù)自發(fā)動作電位，心室肌細(xì)胞動作電位則需要脈沖電流刺激誘發(fā)；心室肌細(xì)胞動作電位時程較長，且有明顯平臺期，竇房結(jié)細(xì)胞動作電位時程較短，無明顯平臺期。此外，和竇房結(jié)細(xì)胞相比，心室肌細(xì)胞靜息電位水平較低。心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞分離方法及電生理特性的差異與二者在結(jié)構(gòu)上所處位置、大小、及心臟起搏過程扮演的角色不同有重要關(guān)系[13-14]。竇房結(jié)是心臟正常節(jié)律性活動的起搏點，其節(jié)律性活動通過房室結(jié)、房室束等組織最后傳至心室，決定了竇房結(jié)細(xì)胞有自發(fā)連續(xù)動作電位，電位上升速率較慢，且靜息時間較短等特點。

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Acute isolation of ventricular and sinoatrial node cells and comparison of action potential in adult rats

FAN Zhuo

(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The method of acute isolation of ventricular myocytes and sinoatrial node cells from adult rats is introduced. The spontaneous action potentials of sinoatrial node cells and evoked action potentials of ventricular myocytes are measured by the whole cell patch clamp technique, and the morphological differences of action potentials waveforms between the two methods are compared. The action potential duration and resting potential levels of ventricular myocytes and sinoatrial node cells are calculated and compared, and the reasons for the difference in electrophysiological characteristics between the two cells are analyzed.

ventricular myocytes; sinoatrial node cells; action potential; action potential duration; resting potential

R-332

B

1002-4956(2019)10-0086-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.10.020

2019-02-21

華南理工大學(xué)校級教研教改項目（Y1180661）；華南理工大學(xué)探索性實驗項目（Y9180540）

范茁（1979—），女，河北定州，博士，實驗師，研究方向為細(xì)胞電生理。E-mail: fanzhuo@scut.edu.cn