低氮對茶樹生長及葉片抗氧化酶活性的影響

林鄭和，鐘秋生，游小妹，陳志輝，陳常頌，單睿陽，阮其春

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)

近幾年來，我國的茶業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快速。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，截至2017年底，我國茶園面積超過4588萬畝，占世界茶園面積總量的一半，年茶葉產(chǎn)量達到269多萬噸[1]，已成為世界上茶葉面積最大，產(chǎn)量最高的國家，茶園氮肥的施用年均66萬噸(每畝茶園按施氮量15 kg計算)。產(chǎn)量隨作物氮肥用量呈線性增加[2]。氮素虧缺直接影響著作物的生命活動和產(chǎn)量形成[3]，氮素虧缺條件下植物的次生代謝發(fā)生的變化，如葉綠體色素和蛋白質(zhì)的丟失、脂質(zhì)過氧化和膜的改變，導(dǎo)致葉片光合能力的逐步下降。然而，Logan等人[4]發(fā)現(xiàn)缺氮的菠菜葉片抗氧化酶顯著增加。為了保護光合作用器官免受氧化脅迫，植物必須消耗掉多余的光能，可以通過葉黃素循環(huán)或者過氧化物酶反應(yīng)降低光化學(xué)效率[5]?；钚匝?ROS)對所有植物體都具有高度破壞性和毒性，必須盡量減少其產(chǎn)生[6,7]，細胞內(nèi)ROS的積累通常較低，但在不利的環(huán)境因素下，ROS的產(chǎn)生可能增強[8]，可引起膜質(zhì)的脫脂化和過氧化，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。然而植物體內(nèi)存在抗氧化機制，可以在一定程度上減緩這種傷害。為了應(yīng)對細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，植物具有復(fù)雜的酶抗氧化系統(tǒng)，其中包括細胞解毒的關(guān)鍵酶，如：單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)等；非酶促抗氧化體系重要的有抗壞血酸(ASC)、還原型谷胱甘肽(GSH)等[9,10]，有效地清除細胞內(nèi)過多的ROS，維持細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除在一個平衡狀態(tài)，使細胞免受傷害。目前低氮對植物活性氧變化影響主要集中在苦蕎[11]、咖啡[12]、小麥[3,13]、玉米[14]，而關(guān)于茶樹氮虧缺對抗氧化酶的影響相關(guān)并未見到。本研究以前期篩選出的耐低氮茶樹品種‘黃棪’與氮敏感茶樹品種‘本山’為試驗材料[15]，測定低氮下ROS及各抗氧化酶活性的變化，以期為茶樹耐低氮種質(zhì)的篩選與鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

試驗于2017年3～10月在福建省福安市社口鎮(zhèn)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所完成。試驗采用盆栽沙培。沙子用干凈的河沙，盆用陶土花盆，大?。焊邽?0 cm，底部直徑為20 cm，頂部直徑為30 cm，每盆裝入6 kg的沙子，沙子使用前用去離子水洗凈、晾干備用。試驗用10月齡的黃棪與本山的扦插苗為材料，每盆栽2株，6個不同濃度(0、50、100、300、1200、6000 μmol·L-1N)的氮處理，每處理20盆，于自然溫、光條件下培養(yǎng)。營養(yǎng)液參照林鄭和[16]的配方配制，完全營養(yǎng)液包含3 mmol·L-1NH4NO3，0.5 mmol·L-1Ca(H2PO4)2，1.0 mmol·L-1K2SO4，0.5 mmol·L-1CaCl2，0.6 mmol·L-1MgSO4，46 μmol·L-1H3BO3，9 μmol·L-1MnSO4，9 μmol·L-1ZnSO4，2 μmol·L-1CuSO4，2.6 μmol·L-1Na2MoO4和30 μmol·L-1Fe-EDTA。具體實施：移栽，待幼苗成活后每次每盆各處理分別施含0、50、100、300、1200、6000 μmol·L-1N的NH4NO3營養(yǎng)液約500 mL，每周3次，處理18周后(缺氮處理出現(xiàn)明顯的癥狀：葉色變黃、植株矮小、分枝減少、葉片衰老加快等)，進行取樣、檢測。為了防止盆栽苗澇害，盆底有個漏洞，放有瓦片，避免積水及沙子遺漏。

1.2 測定方法

1.2.1 植株分枝數(shù)、株高及根莖葉干重的測定 分枝數(shù)與株高的觀測參照《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》。根、莖、葉干重測定參考林鄭和等[16]。茶樹小心從花盆中拔起(保持完整的根系)，用自來水沖洗干凈，然后用剪刀把根、莖、葉分開，每個處理設(shè)置4個重復(fù)(不同盆中的1株為1個重復(fù))，將鮮樣涼干后，放入烘箱中，80℃下烘48 h(至恒重)，然而用電子天平測定各部分的重量。

1.2.2 茶樹根莖葉氮含量的測定 氮含量的測定：采用濃H2SO4-H2O2消煮，用凱氏定氮儀(FOSS)進行測定，參照林鄭和等[15,16]。

1.2.3 茶樹葉片丙二醛(MDA)與過氧化氫(H2O2)的測定 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定，具體參照Hodges等[18]的方法進行。雙氧水(H2O2)的測定參照Chen等[19]。

1.2.4 抗氧化酶活性測定 葉片抗氧化酶活性的提取與測定參考林鄭和等[9]與Chen等[19]，具體步驟如下：從超低溫冰箱中取3個圓葉片(每個葉面積0.608 cm2)，放入研缽中，加2 mL提取液緩沖液[0.5%(w/v)曲拉通X-100，1 mM EDTA，50 mM KH2PO4-KOH(pH 7.5)，5%(w/v)不溶性PVPP]，在冰浴中研磨成勻漿，勻漿用冰凍離心機15 000 g下離心10 min，上清液用于酶活性測定。CAT、APX、MDAR、DHAR和 GR活性測定按Chen等[19]與林鄭和[9]。SOD活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定，GSH和ASC含量測定按照Chen等[19]的方法進行。過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，參考Chen等[19]進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS(V15.10)軟件進行差異顯著性(LSD法)分析，利用Sigmaplot 10.0軟件進行作圖。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)4～6次(不同植株為1個重復(fù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供氮處理對茶樹分枝數(shù)、株高及根莖葉干重的影響

從圖1(A)可看出，隨著供氮濃度的增加兩品種的分枝數(shù)依次顯著增加，除供氮1200 μmol·L-1N處理外，其余處理中黃棪品種的分枝數(shù)顯著高于本山品種，特別在低氮處理(供氮處理為0、50、100 μmol·L-1)下。從圖1(D)中發(fā)現(xiàn)兩品種植株高度在供氮為0、50、100 μmol·L-1顯著下降，其余處理間未見顯著變化。圖1(B、C、E)發(fā)現(xiàn)，隨著供氮濃度的增加，除本山品種在供氮為6000 μmol·L-1外，兩品種根、莖、葉干重依次增加。根系干重除50、100 μmol·L-1氮處理外，其余處理黃棪干重都高于本山，葉片干重在供氮處理為0、50 μmol·L-1時，黃棪品種顯著高于本山，其余處理未見明顯差異。莖干重除供氮處理6000 μmol·L-1，其余處理兩品種未見顯著差異。根冠比(圖1F)在供氮處理下未見顯著差異，而本山品種的根冠比顯著高于黃棪。隨著供氮濃度的增加，兩品種植株干重(圖1G)都依次增加，然而黃棪品種的干重除供氮300 μmol·L-1處理外，其余處理均高于本山。

圖1 供氮處理對茶樹分枝數(shù)、株高及根莖葉干重的影響Fig.1 Branch count, plant height, and dry weight (DW) of roots, stems, and leaves of tea plants in relation to N supply注：每個柱為4次重復(fù)的平均值±標準差，同一點字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同供氮處理對茶樹根系、莖、葉氮含量的影響

從圖2中看出，茶樹隨著供氮濃度從0增加到6000 μmol·L-1，茶樹根、莖、葉氮含量依次增加，其中氮含量葉片>根系>莖。從圖2A與C中發(fā)現(xiàn)相同供氮處理下，黃棪葉片、根系的氮含量都高于本山品種，莖的氮含量(圖2B)除0、100 μmol·L-1處理外，其余處理黃棪都高于本山。

圖2 供氮處理對茶樹根莖葉氮含量的影響Fig.2 N content in roots, stems, and leaves of tea plants in relation to N supply注：每個柱為6次重復(fù)的平均值±標準差，同一點字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同供氮處理對茶樹葉片過氧化氫與MDA含量的影響

從圖3發(fā)現(xiàn)，供氮處理為0、50 μmol·L-1時，葉片過氧化氫的產(chǎn)生速率(圖3A)與MDA(圖3B)含量顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)，本山品種中的過氧化氫與丙二醛都顯著高于黃棪品種。供氮處理從300增加到6000 μmol·L-1，各處理間未見明顯變化。

2.4 不同供氮處理對茶樹葉片抗氧化系統(tǒng)各酶活性的影響

從圖4A中發(fā)現(xiàn)隨著供氮濃度的增加，葉片SOD(圖4A)活性依次下降，而GR(圖4B)、CAT(圖4C)、DHAR(圖4D)、MDAR(圖4E)、APX(圖4F)、POD(圖4G)活性卻依次增加。供氮處理為0、50 μmol·L-1時，黃棪品種葉片的GR(圖4B)、CAT(圖4C)顯著高于本山品種，其余各處理除CAT供氮100 μmol·L-1處理外，其余各處理兩品種間未見顯著變化。DHAR(圖4D)活性除供氮為50 μmol·L-1處理外，其余處理黃棪葉片中的DHAR活性都高于本山；MDAR(圖4E)活性黃棪與本山相當或者本山略高于黃棪；APX(圖4F)活性在供氮從0增加到100 μmol·L-1時，黃棪品種顯著高于本山，其余各處理兩品種未見顯著變化；POD活性(圖4G)除300、1200 μmol·L-1處理本山顯著高于黃棪外，其余處理兩品種未見顯著變化。

圖3 供氮處理對H2O2(A)與MDA(B)含量的影響Fig.3 H2O2 (A) and MDA content (B) in leaves of tea plants in relation to N supply注：每個柱為4次重復(fù)的平均值±標準差，同一點字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 不同供氮處理對茶樹葉片ASC與GSH含量的影響

從圖5發(fā)現(xiàn)，隨著供氮濃度的增加，ASC含量依次增加，而除本山1200 μmol·L-1處理外，GSH含量也隨著供氮的增大而增加。還發(fā)現(xiàn)ASC含量在兩品種間未見明顯差異，而GSH含量黃棪品種明顯高于本山。

3 討論與結(jié)論

作物氮肥通常直接影響作物的生物量、代謝、結(jié)構(gòu)，了解作物對氮素的反應(yīng)機制是維持和提高作物生長和產(chǎn)量的關(guān)鍵，也是提高氮素利用率的關(guān)鍵[20, 21]。缺氮下茶樹分枝數(shù)與樹高顯著的下降(圖1A與D)，氮素限制的主要目標是分生組織[22]，這一結(jié)果與本研究相類似。

圖4 供氮對茶樹葉片SOD(A)、GR(B)、CAT(C)、DHAR(D)、MDAR(E)、APX(F)與POD(G)活性的影響Fig.4 Activities of SOD (A), GR (B), CAT (C), DHAR (D), MDAR (E), APX (F), and POD (G) in leaves of tea plants in relation to N supply注：每個柱為4次重復(fù)的平均值±標準差，同一點字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖5 供氮對茶樹葉片ASC(A)與GSH(B)含量的影響Fig.5 ASC (A) and GSH (B) in leaves of tea plants in relation to N supply注：每個柱為4次重復(fù)的平均值±標準差，同一點字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

本研究表明，隨著供氮濃度的增加，茶樹根、莖、葉干重顯著增加，說明高氮能引起茶樹對氮的奢侈吸收，增加植株氮積累，加速茶樹營養(yǎng)生長，這與水稻[22]、玉米[23]等報到相一致。研究發(fā)現(xiàn)，低氮下茶樹根、莖、葉干重都顯著下降(圖1B、C、E)，這與阮建云等[24]、蘇有健等[25]在茶樹低氮下的報道相一致。主要因為氮含量降低嚴重影響茶樹根、莖、葉中蛋白質(zhì)、氨基酸、光合產(chǎn)物等的合成所致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，黃棪品種施氮下根、莖、葉干重明顯高于本山品種，除根系干重除50、100 μmol·L-1，莖干重6000 μmol·L-1處理外，其余處理黃棪品種均高于本山。從干物質(zhì)分配角度看，品種和氮肥同時起作用，不同基因型茶樹品種對氮肥吸收、利用是不同的，這表明施氮對不同茶樹品種調(diào)節(jié)程度不同，這與徐祥玉等[26]報道相一致。本研究發(fā)現(xiàn)本山品種根冠比都大于黃棪品種，這可能因為供氮下本山品種增強對N及光合作用產(chǎn)物吸收，而使得這些產(chǎn)物累積在根部所致[27-29]，也側(cè)面說明了氮高效品種黃棪在低氮下氮素利用較本山品種高。

氮含量是指單位土地面積上植物各器官所含氮元素的質(zhì)量。缺氮明顯減少茶樹根、莖、葉氮含量，根、葉氮含量的減少較莖更為顯著，葉片氮含量高于根、莖，說明氮素從根系向葉片轉(zhuǎn)運，最后主要累積在葉片，供蛋白質(zhì)、氨基酸等代謝物質(zhì)合成用。在最大供氮時，葉片氮含量增加最大，而在不供氮或者低氮處理時，根莖葉之間氮含量差異很小，說明低氮處理使氮素向地上部(莖和葉)的轉(zhuǎn)移比例增加。這與李強等[30]在水稻上的研究結(jié)果相類似。低氮下本山品種根、莖、葉氮含量都要低于黃棪品種，說明低氮下黃棪品種能更有效的吸收、轉(zhuǎn)運氮。這與魏艷麗等[31]在施氮對不同小麥品種氮素效率利用的報到相一致，氮高效品種氮素利用率更大。其中還發(fā)現(xiàn)黃棪品種根系氮含量隨著供氮的增加，氮含量變化尤為顯著，說明黃棪對氮肥的利用率要高于本山。

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，是衡量細胞膜損傷程度的重要指標。張英鵬等[35]研究表明，在低氮導(dǎo)致了菠菜體內(nèi)MDA和超氧自由基積累，從而使膜脂產(chǎn)生過氧化作用，影響菠菜的正常生長，這與本研究缺氮下葉片MDA含量顯著增加相類似。本研究還發(fā)現(xiàn)缺氮下黃棪品種的GR、CAT、APX與GSH活性都高于本山品種，這與耐氮玉米品種[14]、耐低氮苦蕎品種(‘迪慶苦蕎’、‘廣苦1號’)[11]低氮脅迫下的報道相一致。

綜上所述，缺氮脅迫下導(dǎo)致茶樹幼苗的生長發(fā)育受到抑制(根、莖、葉干重顯著下降)，本山品種根冠比都大于黃棪品種，說明其缺氮對本山品種生長影響較大，耐低氮品種在低氮環(huán)境中具有明顯的生長優(yōu)勢，耐低氮能力較強。缺氮下茶樹MDA與H2O2有所增加，且本山品種增加的尤為顯著，且相關(guān)的抗氧化酶(POD、CAT、GR、GSH等)黃棪品種都高于本山，說明耐低氮品種黃棪缺氮環(huán)境下能更好調(diào)節(jié)保護自身，免受傷害，更好的適應(yīng)缺氮環(huán)境。