醋酸高產(chǎn)菌株的篩選及高酸度蘋果醋的釀造

李 歡 ， 毛 健 *，3，4， 劉雙平 ，3，4， 周志磊

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000；4.江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所，江蘇 如皋226500）

蘋果醋是將蘋果或濃縮果汁作為主要原料，經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵而成的一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味飲品。一般糧食醋中鉀、鋅等微量元素不足，而蘋果醋不僅可以補(bǔ)充這些微量元素，而且還含有較多維生素、多糖、氨基酸等物質(zhì)，有機(jī)酸分布及風(fēng)味口感均比釀造食醋好[1-2]。但市面上的蘋果醋多以食醋調(diào)配制成，口感以苦澀為主，刺激性強(qiáng)，難獲得消費(fèi)者青睞；少數(shù)發(fā)酵蘋果醋采用果汁發(fā)酵，但其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失較大，產(chǎn)量低成本高。隨著人們對(duì)蘋果醋食療保健作用的認(rèn)識(shí)，以及對(duì)高酸度醋功能研究的深入，工業(yè)化生產(chǎn)高效、低成本的液態(tài)高酸度蘋果醋具有非常大的潛在市場(chǎng)。研究高酸度蘋果醋的工藝開發(fā)不僅可以解決蘋果滯銷的經(jīng)濟(jì)問題，還可以提高原料利用率、滿足果醋市場(chǎng)日益增大的需求量[3]。

在果醋生產(chǎn)中，醋酸菌是決定醋酸產(chǎn)量和質(zhì)量的主要菌株。國(guó)內(nèi)廠家常用AS1.41和滬釀1.01生產(chǎn)液態(tài)糧食醋[4]，但這些菌株在果醋釀造中的適用性不強(qiáng)；雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)菌株選育研究較多，但產(chǎn)酸能力和穩(wěn)定性不高，且目前用于高酸度果醋釀造的專用菌株并未明確。同時(shí)，發(fā)酵工藝對(duì)高酸度蘋果醋的生產(chǎn)也至關(guān)重要，現(xiàn)階段對(duì)高酸度發(fā)酵醋的研究集中在糧食醋（總酸質(zhì)量濃度70～100 g/L），多采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵方法，生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[5-6]。而對(duì)果醋研究多為實(shí)驗(yàn)室搖瓶試驗(yàn)，總酸質(zhì)量濃度在50～80 g/L左右，對(duì)高酸度蘋果醋（總酸質(zhì)量濃度＞100 g/L）的釀造工藝，尤其是利用發(fā)酵罐生產(chǎn)液態(tài)高酸度蘋果醋的報(bào)道較少。

作者通過篩選高產(chǎn)醋酸菌株和蘋果醋發(fā)酵罐試驗(yàn)，得到一株高產(chǎn)醋酸的巴氏醋桿菌CYD159，并對(duì)蘋果醋流加發(fā)酵的生產(chǎn)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終可得到120 g/L的高酸度蘋果醋，縮短了生產(chǎn)周期，在提高醋酸產(chǎn)量的前提下降低了生產(chǎn)成本，為高酸度蘋果醋大規(guī)模生產(chǎn)提供理論支持和技術(shù)依據(jù)，具有廣闊的研究前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料 釀造蘋果酒：作者所在實(shí)驗(yàn)室自制；濃縮蘋果汁：市售。

1.1.2 菌株 醋酸菌分別篩選于鎮(zhèn)江醋廠醋酸發(fā)酵液與四川醋廠醋酸發(fā)酵醅。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、無水乙醇、檸檬酸、三氯乙酸、磷酸、亞硫酸鈉：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.4 主要儀器 立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床：上海合恒儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；7230G可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司產(chǎn)品；FA2004N電子分析天平：梅特勒-托利多愛儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)：蘇州富泰潔凈系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；BioFlo 110型發(fā)酵罐：美國(guó)New Brunswick Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，魚粉蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，0.1 MPa滅菌 15 min。

增殖培養(yǎng)基：已滅菌的YPD液體培養(yǎng)基與蘋果酒按體積比3∶2比例混合備用。

篩選培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，魚粉蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，碳酸鈣20 g/L按比例溶于1 L水中，0.1 MPa滅菌15 min后冷卻至室溫，每100 mL培養(yǎng)基使用前加入3 mL無水乙醇。

一級(jí)種子培養(yǎng)基：酵母提取物20 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，0.1 MPa滅菌 15 min后冷卻至室溫，每100 mL培養(yǎng)基中加入3 mL無水乙醇。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：即增殖培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物30 g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂1 g/L，起始裝液量為1 L，0.1 MPa與發(fā)酵罐一起滅菌15 min，冷卻備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高產(chǎn)醋酸菌株的篩選

1）平板初篩將醋酸發(fā)酵液和增殖培養(yǎng)基按體積比1∶1混合，測(cè)定總酸質(zhì)量濃度。當(dāng)總酸增加較為明顯后，用無菌水將增殖培養(yǎng)液無菌倍比稀釋，涂布于篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h。取菌落形態(tài)明顯、生長(zhǎng)速度快的單菌落進(jìn)行劃線分離，至平板上出現(xiàn)產(chǎn)透明圈、形態(tài)一致的單菌落。選取生長(zhǎng)迅速，透明圈大的單菌落接入種子培養(yǎng)基中[7]。

2）定性實(shí)驗(yàn)[8]醋酸形成的鈉鹽或鈣鹽溶液，與三氯化鐵共熱時(shí)會(huì)生成紅褐色沉淀，空白原液無沉淀。取種子培養(yǎng)基中的菌液，6000 r/min、4℃下離心20 min，取5 mL除去菌體的上清液于試管中，以1 mol/L氫氧化鈉中和至pH 7.0，煮沸后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的FeCl3溶液3滴，形成紅褐色沉淀者說明有醋酸產(chǎn)生，對(duì)應(yīng)菌株為產(chǎn)醋酸菌株。

3）高產(chǎn)醋酸菌株復(fù)篩將分離所得的菌株接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30℃、200 r/min，發(fā)酵72 h后取樣測(cè)定總酸質(zhì)量濃度。

4）蘋果醋發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將復(fù)篩得到的產(chǎn)酸量較高的菌株和傳統(tǒng)釀醋工業(yè)中常用菌株滬釀1.01進(jìn)行蘋果醋發(fā)酵，對(duì)比菌株在蘋果醋發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)情況。

1.3.2 菌種鑒定

1）菌種形態(tài)觀察將復(fù)篩得到的菌株在篩選平板培養(yǎng)基上活化24 h，選取長(zhǎng)勢(shì)好、菌落飽滿、形態(tài)明顯的菌落，觀察生長(zhǎng)狀態(tài)及菌落特征。

2）16S rDNA鑒定用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取該菌DNA，并將所得DNA產(chǎn)物通過PCR擴(kuò)增。具體操作及通用引物參照陳洋等[9]人的鑒定方法。將所得PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.3 高酸度蘋果醋釀造實(shí)驗(yàn)

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)高酸度醋酸發(fā)酵一般不能使用一次性加料至最大發(fā)酵體積的方法，因?yàn)橐淮涡园l(fā)酵容易引起菌種老化，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)量下降等問題[10]，所以采取流加方法，又稱分批補(bǔ)料發(fā)酵，往發(fā)酵罐中先加入一定原料發(fā)酵一段時(shí)間，然后逐漸補(bǔ)入酒醪直到酸度不再上升從而結(jié)束發(fā)酵。乙醇是醋酸發(fā)酵的底物，并為醋酸菌生長(zhǎng)代謝提供能量[9]，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)及發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醋酸發(fā)酵影響較大。

初始乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化：用蘋果酒調(diào)整醋酸發(fā)酵的初始乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%，測(cè)定培養(yǎng)0 h和24 h的A600nm值和總酸質(zhì)量濃度，計(jì)算增長(zhǎng)量。

發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化：按1.3.1的方法將種子液接種至1 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，流加蘋果酒調(diào)整發(fā)酵罐內(nèi)的初始乙醇體積分?jǐn)?shù)，其他條件相同。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)乙醇體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)，一次性補(bǔ)加蘋果酒，使發(fā)酵過程中的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別維持在1%、3%、5%、7%、9%，發(fā)酵至第 48 h結(jié)束，測(cè)定發(fā)酵液的最終總酸和乙醇體積分?jǐn)?shù)[12-13]。

2）分割取醋對(duì)蘋果醋發(fā)酵的影響分割取醋是指酒醪加入醋酸發(fā)酵罐后，第一次發(fā)酵接入體積分?jǐn)?shù)10%醋酸菌種子，發(fā)酵成熟后放出1/2或1/3料液，再加入同量的成熟酒醪或酒精繼續(xù)發(fā)酵而不再接入醋酸菌。這種方法有效的降低了醋酸菌種的制作頻次和醋酸菌的變異幾率，減少了醋酸發(fā)酵的遲滯期，從而降低液態(tài)食醋的成本，為企業(yè)帶來了一定的經(jīng)濟(jì)效益[14]。分割發(fā)酵工藝已廣泛應(yīng)用于酒精醋[15]、食醋[16]和其他發(fā)酵產(chǎn)物如檸檬酸[17]、糖化酶[18]、丁醇[19]等，但在蘋果醋生產(chǎn)中報(bào)道較少。

作者以發(fā)酵液總酸變化為指標(biāo)，繪制蘋果醋的產(chǎn)酸曲線，探究分割時(shí)間和分割次數(shù)對(duì)高酸度蘋果醋釀造的影響。

1.4 測(cè)定方法

酒精度、pH、總糖等基本理化指標(biāo)的測(cè)定參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

菌體濃度：使用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的吸光值，用A600nm表示菌體濃度。

總酸測(cè)定[9]（以乙酸計(jì)）：取適量發(fā)酵液超聲5 min除去二氧化碳后，經(jīng)8000 r/min離心5 min，取上清液1 mL，加入50 mL無二氧化碳的蒸餾水，用已標(biāo)定的0.1 mol/L NaOH溶液滴定，直至pH 8.20為終點(diǎn)。計(jì)算公式如下。

式中：X為總酸質(zhì)量濃度（以乙酸計(jì)），g/L；V1為測(cè)定樣品時(shí)，消耗NaOH溶液的體積，mL；V0為空白試驗(yàn)時(shí)，消耗NaOH溶液的體積，mL；V為測(cè)定樣品的體積，mL；CNaOH為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；60為醋酸的相對(duì)分子質(zhì)量，g/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)醋酸菌株的篩選

2.1.1 平板初篩結(jié)果 在篩選平板上，產(chǎn)酸的菌能利用培養(yǎng)基中的乙醇產(chǎn)生乙酸，產(chǎn)物乙酸與碳酸鈣反應(yīng)，因此產(chǎn)酸菌株周圍會(huì)產(chǎn)生較清晰的透明圈。以透明圈直徑與菌落直徑之比（U值）大小為標(biāo)準(zhǔn)[4]，從鎮(zhèn)江恒順醋廠發(fā)酵液和四川醋廠的醋酸發(fā)酵醅中初篩得到了20株產(chǎn)酸菌株，其初篩結(jié)果如表1所示。

表1 菌株的初篩結(jié)果Table1 Initial screening results of strain

在初篩培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)48 h后，菌株CYD93、CYD114、CYD191透明圈最大，說明這 3株菌生長(zhǎng)能力旺盛，能夠利用乙醇作為碳源迅速繁殖生長(zhǎng)。根據(jù)透明圈與菌落大小的比值，發(fā)現(xiàn)菌株CYD1、CYD47、CYD55、CYD123、CYD161、CYD159、CYD191、CYD202比值均大于3，初步判斷這幾株菌分解利用乙醇的能力相對(duì)較強(qiáng)。

2.1.2 醋酸定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，按表1順序從左至右依次排開，只有菌株CYD21、CYD47、CYD93所對(duì)應(yīng)的試管底部未生成紅褐色沉淀，其他17株所對(duì)應(yīng)的試管受熱后均產(chǎn)生了紅褐色沉淀，由此證明 CYD21、CYD47、CYD93不是醋酸菌，其余17株菌均為產(chǎn)醋酸的菌株。

2.1.3 產(chǎn)醋酸菌株復(fù)篩結(jié)果比較 初篩后對(duì)17株產(chǎn)醋酸的菌株進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2，種子培養(yǎng)基的初始酸質(zhì)量濃度均為3.2 g/L左右，經(jīng)過72 h恒溫?fù)u床培養(yǎng)后，只有CYD55、CYD159和CYD202的產(chǎn)酸量達(dá)到了20 g/L以上，分別為21.20、24.83、20.99 g/L。其次是CYD155、CYD139的產(chǎn)酸量在7 g/L左右，其余菌株均低于6 g/L，因此選取CYD55、CYD159和CYD2023株菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株。

圖1 醋酸定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Qualitative results of acetic acid

圖2 不同菌株產(chǎn)酸量結(jié)果Fig.2 Acid yield of different bacteria

2.1.4 蘋果醋發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn) 將產(chǎn)酸量較高的3株菌和滬釀1.01進(jìn)行蘋果醋發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，控制發(fā)酵條件相同，測(cè)定了4株菌的生物量變化情況和產(chǎn)酸曲線。從圖3（a）中看出，生長(zhǎng)速度由高到低分別是滬釀 1.01、CYD159、CYD55、CYD202， 但滬釀 1.01 的生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，在整個(gè)發(fā)酵過程中，其A600nm遠(yuǎn)高于其他3株菌，說明該菌株可以較快適應(yīng)環(huán)境并較快利用乙醇，積累醋酸。從產(chǎn)酸曲線中可以看出，滬釀1.01比其他3株菌起酵快，在20 h時(shí)已達(dá)到最高酸度， 而 CYD55、CYD159、CYD202分別在發(fā)酵 40 h、40 h和36 h時(shí)達(dá)到最高酸度。但CYD159較其他3株菌的產(chǎn)酸能力明顯高，蘋果醋發(fā)酵過程中總酸質(zhì)量濃度高達(dá)65.6 g/L，其他3株菌的酸質(zhì)量濃度均低于60 g/L。通過4株菌的發(fā)酵特性對(duì)比，滬釀1.01在蘋果醋發(fā)酵過程中菌濃度最高但產(chǎn)酸能力較低，并不是釀造高酸度蘋果醋的最適菌株；CYD159則顯現(xiàn)出較好的發(fā)酵特性，起酵速度略低于滬釀1.01，但發(fā)酵過程中醋酸積累多，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株。

圖3 不同菌株的發(fā)酵性能對(duì)比Fig.3 Fermentation characteristic of strains

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)觀察 如圖4所示，菌株CYD159的菌落為圓形、乳白色、邊緣光滑有明顯凸起。經(jīng)美藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察如圖5，細(xì)胞無芽孢，呈短桿狀，單個(gè)或成對(duì)成鏈出現(xiàn)。

圖4 菌株CYD159的菌落特征Fig.4 Colony characteristics of CYD159

圖5 菌株CYD159的菌體形態(tài)Fig.5 Thalli properties of CYD159

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 如圖6所示，菌株CYD159經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的16S rDNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，該菌株在凝膠上出現(xiàn)了一條亮帶，大約1600 bp。

圖6 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA obtained from CYD159

將所得序列在GenBank中使用Blast程序進(jìn)行同源性比較后發(fā)現(xiàn)該菌株與巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）有很高的同源性，達(dá)到99%；用MEGA 7.0軟件，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示，菌株CYD159與巴氏醋桿菌關(guān)系親近，可以確定是巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。保藏武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2015418。

圖7 CYD159的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain CYD159

2.3 高酸度蘋果醋釀造實(shí)驗(yàn)

2.3.1 發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

1）初始乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 隨著初始乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，發(fā)酵24 h時(shí)菌體A600nm和產(chǎn)酸量都呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。由圖8可知，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，醋酸菌由于底物體積分?jǐn)?shù)過低，不能滿足其基本需求，生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力都最低；初始乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，菌體增長(zhǎng)量開始下降，說明此濃度對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)已產(chǎn)生抑制作用，但經(jīng)過一段時(shí)間適應(yīng)后，其總酸仍在積累。但乙醇體積分?jǐn)?shù)高達(dá)11%時(shí)，菌體幾乎停止增長(zhǎng)，產(chǎn)酸量較低。初始乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，但由于發(fā)酵過程中總乙醇體積分?jǐn)?shù)只有3%，導(dǎo)致總酸增長(zhǎng)量比高體積分?jǐn)?shù)乙醇的對(duì)照組低，說明通過適當(dāng)補(bǔ)給碳源，該醋酸菌仍有能力繼續(xù)合成乙酸。為避免乙醇的底物抑制作用，縮短菌種的發(fā)酵延滯期，所以選取3%作為蘋果醋發(fā)酵的初始乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖8 初始乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘋果醋發(fā)酵的影響Fig.8 Influence of initial ethanol concentration to apple vinegar fermentation

2）發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定發(fā)酵初始體積1.25 L，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)3%，總酸3 g/L左右，當(dāng)發(fā)酵至12 h，發(fā)酵罐內(nèi)乙醇體積分?jǐn)?shù)降至0，總酸達(dá)到25 g/L左右，菌體濃度3.6左右，說明醋酸菌已開始發(fā)酵，此時(shí)補(bǔ)加蘋果酒調(diào)整發(fā)酵過程中的乙醇體積分?jǐn)?shù)，發(fā)酵第48 h取樣，測(cè)得參數(shù)見表2。

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘋果醋發(fā)酵的影響Table2 Influence of ethanol concentration to apple vinegar fermentation

發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%和3%時(shí)，醋酸菌代謝旺盛，乙醇轉(zhuǎn)化率較高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于3%，乙醇轉(zhuǎn)化率明顯下降，說明醋酸菌在一定體積分?jǐn)?shù)的乙酸的作用下，對(duì)環(huán)境中乙醇較為敏感，乙醇耐受能力有所下降[20]，當(dāng)發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)高于5%時(shí)，醋酸菌CYD159難以維持較高的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力，進(jìn)而對(duì)乙醇的利用率降低[21]，造成殘酒，對(duì)高酸度蘋果醋釀造產(chǎn)生不良影響。此外，大多數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中采用人工分時(shí)補(bǔ)料方式，這種方法會(huì)對(duì)發(fā)酵過程造成較大沖擊[22]，使發(fā)酵過程的溫度、pH值和溶解氧等參數(shù)波動(dòng)。因此，為提高原料利用率，實(shí)現(xiàn)高酸度蘋果醋的生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中應(yīng)通過控制流加速率的方法補(bǔ)加乙醇體積分?jǐn)?shù)并控制在3%以下，避免一次性補(bǔ)加過量乙醇。

2.3.2 發(fā)酵過程中分割次數(shù)的確定 前期實(shí)驗(yàn)通過補(bǔ)料流加蘋果酒的方法，盡可能降低了初期和發(fā)酵過程中底物乙醇對(duì)醋酸菌的抑制，但在醋酸發(fā)酵后期，隨著發(fā)酵液中乙酸體積分?jǐn)?shù)的增加，產(chǎn)物抑制效應(yīng)隨之加劇，醋酸菌的產(chǎn)酸能力和對(duì)乙酸的抗性都會(huì)降低，致使醋酸積累量不足，難以獲得高酸度蘋果醋。通過多次發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，及時(shí)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分割，可以降低乙醇和醋酸的協(xié)同脅迫，因此對(duì)發(fā)酵中分割時(shí)間和次數(shù)進(jìn)行了探討。

高素國(guó)[14]等人指出分割取醋工藝順利實(shí)施的關(guān)鍵是醋酸發(fā)酵結(jié)束后放料的時(shí)機(jī)。通常情況下要求醋酸發(fā)酵醪中殘留乙醇體積分?jǐn)?shù)在0.3%～0.5%之間，因此該實(shí)驗(yàn)除了殘留乙醇體積分?jǐn)?shù)，還以發(fā)酵液中總酸質(zhì)量濃度不再明顯上升為主要指標(biāo)。如圖9所示，當(dāng)發(fā)酵液酸度不再增加時(shí)，反而有所下降，說明菌體產(chǎn)酸速率已下降，醋酸發(fā)酵結(jié)束，因此可在達(dá)到最高酸度之前分割取醋，避免醋酸菌的乙酸過氧化作用，保證蘋果醋的品質(zhì)和產(chǎn)物質(zhì)量濃度。最終確定了分割時(shí)間分別為 36、66、85、140 h。

由圖10可知，每次分割后發(fā)酵液酸度下降，醋酸菌在短時(shí)間內(nèi)處于對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)期，產(chǎn)酸速度也較慢，但此后酸度變化較快并在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高值。分割次數(shù)少于4次時(shí)，發(fā)酵達(dá)到最高酸度的時(shí)間隨次數(shù)的增加越來越短，分別為36、29、20 h。因?yàn)楫?dāng)進(jìn)行分割發(fā)酵時(shí)，不需要種子擴(kuò)培過程，通過利用發(fā)酵罐中剩余的菌種起始發(fā)酵，可以實(shí)現(xiàn)半連續(xù)流加發(fā)酵生產(chǎn)；而且每次分割后補(bǔ)料使總酸下降，但起始酸度隨分割次數(shù)逐漸提高，醋酸菌對(duì)高酸環(huán)境的適應(yīng)變強(qiáng)，能在酸度越來越高的環(huán)境下迅速積累醋酸。但并不是分割次數(shù)越多越好，當(dāng)140 h時(shí)進(jìn)行第4次分割后，酸度長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)無明顯上升，反而有所下降，可能醋酸菌總數(shù)隨分割次數(shù)增多而越來越低，能繼續(xù)產(chǎn)酸的醋酸菌變少，導(dǎo)致總體生產(chǎn)強(qiáng)度下降[21]，發(fā)酵結(jié)束。

圖9 分割時(shí)間的確定Fig.9 Determination of the multi-stage fermentation

圖10 分割次數(shù)對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.10 Influence of the multi-stage fermentation on the Acid Production

因此分別在36、66、85 h分割3次時(shí)，高酸度蘋果醋發(fā)酵工藝最優(yōu)，發(fā)酵第140 h時(shí)可生產(chǎn)總酸（以乙酸計(jì)）120 g/L蘋果醋，是同菌種單批發(fā)酵總酸產(chǎn)量（圖3a，61.6 g/L）的2倍，并經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)說明該生產(chǎn)工藝可重復(fù)，菌株CYD159穩(wěn)定性高，并具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

3 結(jié) 語

以醋廠的醋酸發(fā)酵液、醋酸發(fā)酵醅為原料，通過平板初篩、定性實(shí)驗(yàn)、以及產(chǎn)酸能力和蘋果醋發(fā)酵性能的比較，得到一株高產(chǎn)醋酸且產(chǎn)酸穩(wěn)定的醋酸菌CYD159。經(jīng)過菌種鑒定，該菌株為巴氏醋桿菌。采取流加發(fā)酵的方法，探究了底物乙醇體積分?jǐn)?shù)和分割發(fā)酵的次數(shù)對(duì)蘋果醋發(fā)酵的影響并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液初始乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，并通過調(diào)整流加速率，使罐內(nèi)乙醇體積分?jǐn)?shù)不超過3%，分別在36、66、85 h分割3次時(shí)，可得到總酸120 g/L的高酸度蘋果醋。

綜上，作者篩選得到了一株高產(chǎn)醋酸的醋酸菌并應(yīng)用于高酸度蘋果醋的釀造，經(jīng)過流加發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化和多次實(shí)驗(yàn)，該生產(chǎn)工藝可靠，且菌株CYD159產(chǎn)酸能力強(qiáng)且穩(wěn)定性高，為高酸度蘋果醋的大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的理論支持和技術(shù)依據(jù)。