液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定普洱茶中16種真菌毒素

胡 琳，師 真，趙 麗，劉曉松，董玉英，蔣孟圓，*，李文廷，*

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500； 2.昆明市疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650228)

普洱茶出自云南省的大葉種茶，經(jīng)獨(dú)特的微生物發(fā)酵而成，是國內(nèi)市場最受歡迎的茶葉品類。近年來，由于普洱茶具有降血脂、抗氧化、減肥、抗菌等多重保健功效而備受歡迎[1]，但茶葉在發(fā)酵生產(chǎn)加工和保存過程中，有可能被真菌毒素污染，其安全性對消費(fèi)者健康以及茶葉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展尤為重要[2-3]。

真菌毒素是由真菌次生代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，農(nóng)產(chǎn)品在生長階段、收獲時(shí)節(jié)、產(chǎn)品加工及儲存期間，均可能被真菌毒素污染，其對人體的健康存在極大的威脅，可使動物出現(xiàn)急性、亞急性、慢性中毒癥狀[4-5]。黃曲霉毒素是一種天然存在的最強(qiáng)致癌物之一，主要有AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2四種，其中以AFTB1毒性最強(qiáng)。伏馬毒素是新發(fā)現(xiàn)的新型、強(qiáng)毒性的生物毒素，主要包括FB1、FB2、FB3。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇也是最常見的一類污染性真菌毒素，食用低劑量的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇會引起食欲下降、嘔吐等癥狀。因此，嚴(yán)格控制茶葉中的真菌毒素含量與百姓的安全健康息息相關(guān)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染，造成的損失達(dá)數(shù)百億美元。近年來，世界各地已經(jīng)紛紛高度重視真菌毒素的污染問題，并著手研制相應(yīng)的測定方法以及限量要求，我國也新出GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn)，增加了真菌毒素的檢測范圍及相應(yīng)含量限制[6-7]。

真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫親和凈化-液相色譜法、免疫親和柱色譜-酶聯(lián)免疫吸附法[8-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。由于茶葉中存在茶多酚和茶色素等復(fù)雜基質(zhì)的干擾，一般的酶聯(lián)免疫及液相色譜法在測定真菌毒素時(shí)容易產(chǎn)生“假陽性”結(jié)果，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、多種組分同時(shí)檢測等技術(shù)優(yōu)點(diǎn)成為目前較為推廣的檢測方法[12-14]，文獻(xiàn)有報(bào)道對部分茶葉中幾種真菌毒素進(jìn)行檢測分析，但樣品檢測范圍較廣且檢測項(xiàng)目較少[15-20]，本實(shí)驗(yàn)主要針對云南在售普洱茶，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測16種真菌毒素的檢測方法，以期全面提供更為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為相關(guān)部門對普洱茶的監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(美國Agilent Technologies公司1290 Infinity Ⅱ-美國AB SCIEX公司QTRAP 4500)，具有電噴霧離子源；十萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo公司XS205DU)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司 KQ-500DE)；純水處理終端機(jī)(德國Sartorius公司Arium pro D1)；免疫親和凈化柱(Pribolab中國公司PriboFast?Multi-Toxin IAC)；智能臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南赫儀器裝備有限公司3H16RI)。

1.2 試劑

16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)黃曲霉毒素B1(AFTB1)、黃曲霉毒素B2(AFTB2)、黃曲霉毒素G1(AFTG1)、黃曲霉毒素G2(AFTG2)、雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-AcDON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-AcDON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)、T-2毒素(T-2)、HT-2 毒素(HT-2)、雜色曲霉毒素(ST)及15種同位素內(nèi)標(biāo)：13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-AFTG1、13C17-AFTG2、13C15-NIV、13C15-DON、13C15-3-AcDON、13C18-ZEN、13C20-OTA、13C34-FB1、13C34-FB2、13C34-FB3、13C24-T-2、13C22-HT-2、13C18-ST購自Pribolab中國公司；已知質(zhì)控樣購自美國Romer Labs公司；色譜純的甲醇、乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司；實(shí)驗(yàn)中所用水為去離子水。

1.3 材料

檢測茶葉樣品由云南各州市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行采集提供，昆明市、大理市及普洱市各26件，德宏州28件，大理市24件，迪慶州、臨滄市、玉溪市、曲靖市、保山市、麗江市、楚雄州、紅河州、怒江市、文山州、昭通市各4件，共計(jì)普洱茶174件，生普洱茶和熟普洱茶各87件，每個(gè)地方均按照1∶1數(shù)量送樣。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別將16種真菌毒素用乙腈稀釋為2.0 μg·mL-1的中間液，依據(jù)16種真菌毒素在質(zhì)譜MRM模式下響應(yīng)強(qiáng)度的不一致性，移取一定量中間液適度稀釋進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的尋找及優(yōu)化，精確量取一定體積的16種真菌毒素單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，精確量取一定體積的15種各真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，充分混勻后制得不同質(zhì)量濃度混合真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)工作液，黃曲霉毒素系列同位素內(nèi)標(biāo)濃度為0.01 μg·mL-1，伏馬毒素B2、B3和赭曲霉毒素A的同位素內(nèi)標(biāo)濃度為0.2 μg·mL-1，其余真菌毒素的同位素內(nèi)標(biāo)濃度均為0.5 μg·mL-1，分別避光儲存于-20 ℃條件下。

1.4.2 樣品溶液的制備

精確稱量2 g普洱茶試樣(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇-水-甲酸(70∶29∶1，體積比)，渦旋1 min，加入20 μL混合真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)工作液，超聲提取20 min，渦旋振蕩提取30 min，轉(zhuǎn)移至高速冷凍離心機(jī)以10 000 r·min-1離心5 min，如溶液出現(xiàn)渾濁，用玻璃纖維濾紙過濾，取10 mL上清液通過PriboFast?Multi-Toxin IAC免疫親和凈化柱，依次用0.5%吐溫-水溶液20 mL、去離子水10 mL淋洗柱子，棄去清洗液，加入2 mL甲醇-乙酸(體積比98∶2)洗脫親和柱，重復(fù)操作1次，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，加?0%的乙腈-水溶液0.5 mL溶解，過0.22 μm濾膜，供測試待用。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 C18柱(柱長50 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.8 μm)，柱溫設(shè)定40 ℃，流動相為梯度洗脫，A相：乙腈，B相：0.2%甲酸水溶液，流速為0.3 mL·min-1，樣品進(jìn)樣體積15 μL，檢測運(yùn)行時(shí)間8.0 min。

1.4.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多離子反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)，離子源溫度550 ℃，離子噴霧電壓(ion spray voltage)為5 500.0 V，氣簾氣為30 psi，霧化氣為55 psi，輔助氣為55 psi。

1.4.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將16種真菌毒素以及15種同位素內(nèi)標(biāo)分別用乙腈稀釋至質(zhì)量濃度400 μg·L-1，以7 μL·min-1的流速在流動注射的方式下分別采取正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行一級質(zhì)譜(Q1 MS)掃描，尋找目標(biāo)化合物的母離子，二級質(zhì)譜Product Ion Scan(MS2)掃描選取強(qiáng)度最高的碎片離子作為定量離子，以強(qiáng)度次高的離子作為定性離子。用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分別優(yōu)化目標(biāo)化合物的錐孔電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜條件，最終得到樣品檢測的質(zhì)譜參數(shù)，如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測模式的選擇

通過對16種真菌毒素和15種同位素內(nèi)標(biāo)的母離子及子離子的尋找，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及同位素內(nèi)標(biāo)只有在負(fù)離子模式中有響應(yīng)，而其余的在正離子模式下有較好的響應(yīng)，所以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及同位素內(nèi)標(biāo)選擇負(fù)離子模式檢測，其余真菌毒素選擇正離子模式檢測。

2.2 色譜條件的選擇

流動相分別選擇了乙腈、甲醇作為A相有機(jī)相，0.2%氨水、0.2%甲酸及純水作為B相水相，進(jìn)行組合條件的考察，結(jié)果表明，乙腈-0.2%氨水組合作為負(fù)離子檢測模式流動相，乙腈-0.2%甲酸作為正離子檢測模式流動相， 目標(biāo)分析物的分離效果、質(zhì)譜信號響應(yīng)強(qiáng)度以及出峰狀況最佳，正負(fù)離子模式梯度洗脫程序均為：0～1.0 min，80% B；1.0～2.5 min，80% B～40%B；2.5～4.5 min，40% B～0% B；4.5～5.5 min，0% B；5.5～7.0 min，0% B～80% B；7.0～8.0 min，80% B，流動相只用到A、B兩相，A+B為100%。通過優(yōu)化好的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，真菌毒素及同位素內(nèi)標(biāo)的總離子圖(TIC)見圖1，各真菌毒素的MRM色譜圖分別見圖2。

表1 十六種真菌毒素及15種同位素內(nèi)標(biāo)在MRM模式下檢測的質(zhì)譜參數(shù)

Table1Mass spectrum parameters of 16 kinds of mycotoxins and 15 isotope internal standards detected in MRM mode

*為定量離子；DON采用負(fù)離子模式。

* represented quantitative ion; DON were detected in negative ion mode.

2.3 線性關(guān)系及靈敏度

依據(jù)16種真菌毒素在質(zhì)譜MRM模式下有差異較大的響應(yīng)強(qiáng)度，測試的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制為不同質(zhì)量濃度范圍的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各種真菌毒素定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度(μg·L-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比(S/N)計(jì)算出檢出限(limit of detection，LOD)，10倍信噪比計(jì)算出定量限(limit of quantity，LOQ)，線性關(guān)系參數(shù)見表2。

2.4 凈化方式的選擇

由于普洱茶中具有色素等復(fù)雜基質(zhì)干擾，對儀器離子源的污染及樣品的檢測分析都有較大影響。本文通過16種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及普洱茶基質(zhì)加標(biāo)考察了PriboFast?Multi-Toxin IAC免疫親和凈化柱、PriboFast?M226多功能凈化柱及0.22 μm濾頭的對比實(shí)驗(yàn)，混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過三種凈化方式處理，其柱效均在95%以上無明顯差異，但基質(zhì)加標(biāo)溶液經(jīng)多功能凈化柱及濾頭凈化后，色譜峰受基質(zhì)影響分離效果較差，TIC如圖3所示，而免疫親和柱具有特異吸附功能，樣品經(jīng)0.5%吐溫 PBS稀釋后過柱，用純水、0.5%的吐溫水溶液及純水3次清洗雜質(zhì)，洗脫凈化后的樣品各真菌毒素的色譜峰分離情況良好，TIC如圖1所示，實(shí)驗(yàn)表明，普洱茶的樣品處理應(yīng)采取免疫親和柱凈化。

圖1 除DON外的15種真菌毒素的TIC圖

圖2 十六種真菌毒素的MRM色譜圖

表2 十六種真菌毒素的線性關(guān)系、檢測限

Table2Linear relationship and detection limit of 16 mycotoxins

真菌毒素Mycotoxin線性方程Linearequation相關(guān)系數(shù)r線性范圍Rangeoflinearity/(μg·L-1)檢出限Limitofdetection/(μg·kg-1)定量限Limitofquantity/(μg·kg-1)AFTB1y=32029.3x+122993.70.99565.32～199.500.050.15AFTB2y=53555.6x+4023.80.99761.40～52.500.100.30AFTG1y=24794.9x+3163.40.99395.32～199.500.050.15AFTG2y=14492.7x-964.60.99911.40～52.500.100.30T-2y=64.8x+243.40.99965.32～199.500.200.60HT-2y=35.8x+359.70.99915.32～199.500.200.60NIVy=50570.9x+25048.00.99645.32～199.5014.0042.00FB1y=889.2x-180.90.99845.32～199.500.200.60FB2y=20038.6x-37585.10.99795.32～199.500.501.50FB3y=38492.4x-77307.00.99825.32～199.500.501.50DONy=4.6x+246.40.99455.32～199.502.006.003-AcDONy=164.06x+453.60.99405.32～199.502.507.5015-AcDONy=203.2x+181.560.99785.32～199.503.009.00ZENy=4578.9x+640.90.99465.32～199.501.003.00STy=91675.9x+60965.90.99825.32～199.502.006.00OTAy=839.4x-3905.10.99865.32～199.500.100.30

圖3 未用免疫親和柱凈化的TIC色譜圖

2.5 回收率及精密度

稱取18份2.0 g普洱茶樣品，根據(jù)16種真菌毒素在質(zhì)譜中的響應(yīng)強(qiáng)度，樣品添加10、30、50 μg·kg-1三種濃度水平進(jìn)行真菌毒素的基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照樣品溶液的制備條件處理，每種進(jìn)行6個(gè)水平測定，計(jì)算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行方法精密度考察，16種真菌毒素的回收率范圍為84.2%～102.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2.18%～4.78%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3所示。

2.6 質(zhì)量控制

分別稱取5 g(精確到0.01 g)真菌毒素質(zhì)控樣各3份，依據(jù)樣品前處理方法進(jìn)行處理，檢測值均符合標(biāo)準(zhǔn)證書要求，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，普洱茶樣品按照此種方法提取凈化分析，具有較高的提取效率，準(zhǔn)確度較好。

表3 真菌毒素的加標(biāo)回收率(n=6)

Table3Recoveries of mycotoxins (n=6)

真菌毒素Mycotoxin10μg·kg-1回收率Recoveryrate/%RSD/%30μg·kg-1回收率Recoveryrate/%RSD/%50μg·kg-1回收率Recoveryrate/%RSD/%AFTB190.43.5190.83.2591.33.08AFTB291.24.3191.54.4292.83.94AFTG189.54.5890.14.4391.24.03AFTG290.33.2492.43.7492.22.45T-284.24.1286.34.3788.63.85HT-284.63.5485.14.2088.73.62NIV86.42.5288.93.5791.52.58FB194.53.6396.03.54102.74.24FB291.14.2593.84.3295.24.78FB391.23.6892.13.7194.54.30DON90.34.2591.54.0894.13.513-AcDON91.33.6292.03.1693.33.6215-AcDON87.54.2689.14.0690.24.42ZEN92.62.8694.72.5897.33.05ST87.34.0387.94.2389.54.07OTA92.53.2595.62.1895.32.84

表4 準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)

Table4Accuracy data

μg·kg-1

2.7 實(shí)際樣品檢測

174件普洱茶樣品中有4種真菌毒素檢出，其余為未檢出，檢出的項(xiàng)目分別為雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3，4種真菌毒素的檢測值范圍為0.2～6.0 μg·kg-1，所檢測的普洱茶樣品的總檢出率為6.21%，根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)[21]以及部分國家的標(biāo)準(zhǔn)的限量要求[22]，普洱茶中雖有真菌毒素檢出，但都符合限量標(biāo)準(zhǔn)要求，說明普洱茶可以放心飲用，真菌毒素含量檢出情況見表5。

2.8 樣品確認(rèn)

由于茶葉中基質(zhì)較為復(fù)雜，普通的樣品凈化方式雜質(zhì)引入較多，對目標(biāo)化合物存在較大的干擾，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此，確認(rèn)樣品時(shí)，樣品的定性定量離子、離子對相對豐度比及保留時(shí)間均應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，確認(rèn)是否與標(biāo)準(zhǔn)品一致。

表5 真菌毒素含量檢出詳情

Table5Detecting details of mycotoxins content

真菌毒素Mycotoxin檢出含量范圍Detectionrangeofcontent/(μg·kg-1)參考限值Referencelimit/(μg·kg-1)檢出率Detectionrate/%DON2.0～6.0100030.63FB10.2～1.8100055.17FB20.5～4.210006.90FB30.5～4.110006.90

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采取甲醇水提取，通過免疫親和柱凈化，建立了用LC-MS/MS同時(shí)檢測普洱茶葉中多種真菌毒素的方法，具有較便捷的前處理?xiàng)l件、較好的凈化效果、良好的加標(biāo)回收率、較高的準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，實(shí)際樣品檢測數(shù)據(jù)表明，該方法可以滿足普洱茶中多種真菌毒素同時(shí)檢測分析，可應(yīng)用于茶葉特別是大批量樣品中多種真菌毒素的快速檢測。