一株Fusarium oxysporum f. sp. niveum拮抗菌的篩選、鑒定及其抑菌特性

王恒煦，徐偉慧，*，楊友財(cái)，王志剛，劉澤平，王可昕

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江理工生物科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150000)

西瓜是世界上分布最廣的水果作物之一[1]，由西瓜?；图怄哏牭毒?Fusariumoxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)on)引起的西瓜枯萎病已成為制約西瓜生產(chǎn)的主要因素之一[2]。近年來(lái)，隨著我國(guó)設(shè)施栽培面積不斷擴(kuò)大，連作栽培導(dǎo)致西瓜枯萎病的危害加重[3]，發(fā)病率可達(dá)80%以上，甚至致西瓜絕產(chǎn)絕收[4]。該病菌從西瓜植株根部傷口或根毛頂端細(xì)胞間侵入，在維管束導(dǎo)管內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育[5]，阻塞導(dǎo)管并且影響水分運(yùn)輸，引起植株萎蔫并分泌毒素干擾寄主代謝功能，使寄主植物中毒死亡[6]。西瓜枯萎病的防治問(wèn)題引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并分別從化學(xué)殺菌劑[7]、植物抗性[8]、間混套作[9]、嫁接[10]等方面展開(kāi)了一系列的防治研究，但這些防治措施各有利弊?；瘜W(xué)防治污染環(huán)境，農(nóng)藥殘留危害人畜健康；抗病育種周期長(zhǎng)，成本高；間混套作防效慢，效果滯后；嫁接防治需要大量的人力和物力且使果實(shí)的口感變劣[6]。所以，尋找綠色、環(huán)保、高效和安全的微生物制劑已成為近年來(lái)防治西瓜枯萎病的重要手段[11]。本研究以齊齊哈爾青昕蔬菜基地作物根際土樣和Fon為試材，在室內(nèi)篩選能高效抑制Fon的拮抗菌株，通過(guò)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其抑制西瓜枯萎病能力并對(duì)其抑菌特性進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步的大規(guī)模田間試驗(yàn)提供基礎(chǔ)理論支持，并為西瓜枯萎病生防制劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土樣、幼苗和菌株

土樣、西瓜幼苗均選自黑龍江省齊齊哈爾市青昕蔬菜基地；Fusariumoxyxporumf. sp.Niveum，race 2分離于青昕蔬菜基地西瓜枯萎病病株，由齊齊哈爾大學(xué)微生物生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自然pH，定容至1 000 mL。121 ℃滅菌 30 min，用于Fon菌株平板培養(yǎng)與活化。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，調(diào)節(jié)pH至7，定容至1 000 mL。121 ℃滅菌30 min，用于WD菌株平板培養(yǎng)與活化。

NB培養(yǎng)基：在NA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去掉瓊脂，用于WD菌株的菌液培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選與鑒定

將10 g混合土樣置于含有玻璃珠和90 mL水的錐形瓶中，充分振蕩20 min，取1 mL土壤懸浮液加入盛有9 mL無(wú)菌水的試管中，混合均勻得到10-1稀釋液，通過(guò)梯度稀釋法依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的土壤懸浮液[12]；從10-7、10-8、10-9的試管中分別取0.2 mL于NA培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋涂布，最后將平板倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。將篩選出的菌株通過(guò)平板劃線法接種到NA培養(yǎng)基，置于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)3 d，利用平板對(duì)峙法篩選Fon的拮抗菌株。將篩選出的拮抗菌株采用平板劃線法在NA培養(yǎng)基30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h， 觀察其菌落形態(tài)；用革蘭氏染色法對(duì)菌體染色并用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)[13]。

將具有拮抗性的菌株接種至NA培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。3 d后用接菌環(huán)從生長(zhǎng)良好的平板上挑取拮抗菌株，將其接種到NB培養(yǎng)液中，于30 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h?；罹屯虾Ｃ兰镝t(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA、gyrA、gyrB測(cè)序分析。16S rDNA引物為27F(5′-AGAGTTTATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR反應(yīng)體系(50.0 μL)：DNA模板2 μL，10×ExTaqbuffer 5.0 μL，正向引物(27F)1.0 μL，反向引物(1492R)1.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4.0 μL，5 U ExTaq酶0.5 μL，ddH2O 36.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4.0 ℃終止反應(yīng)。gyrA引物為42F(5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′)和1066R(5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′)，gyrB引物為UP1(5′-GAAGTCATCATGAC CGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和(5′-UP2RAGCAGGGTACGGATGTGCG AGCCRTCNACR TCNGCRTCNGTCAT-3′)，PCR反應(yīng)體系(50.0 μL)：DNA模板2 μL，10×ExTaqbuffer 5.0 μL，正向引物(42F/UP1)2.0 μL，反向引物(1066R/UP2R)2.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 4.0 μL，5 U ExTaq酶0.5 μL，ddH2O 34.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，51/57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，24個(gè)循環(huán)。測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 拮抗菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將拮抗菌株接種于NB培養(yǎng)液中，于30 ℃、120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定其吸光度D600，測(cè)至76 h，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 拮抗菌株的生防試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：WD、CK1和CK2。西瓜兩葉一心時(shí)(8 cm×8 cm營(yíng)養(yǎng)缽，150 g自然土)，WD處理每株苗均澆灌22 mL菌懸液(D600=1.0)，培養(yǎng)3 d后再接入Fon孢子懸液16.5 mL(106mL-1)；CK2處理每株苗均澆灌無(wú)菌NB培養(yǎng)基，3 d后再接入相同量的Fon孢子懸液；CK1處理每株苗均不澆WD菌懸液和Fon孢子懸液，澆灌相同體積的無(wú)菌水。每個(gè)處理3組重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8株[14]。將西瓜幼苗置于人工氣候箱中培養(yǎng)(30 ℃ 光照12 h，18 ℃ 黑暗12 h，相對(duì)濕度60%)，試驗(yàn)期間正常管理，待植株發(fā)生西瓜枯萎病時(shí)，記錄并分析其發(fā)病率[15]。

發(fā)病率(%)=發(fā)病植株數(shù)/總植株數(shù)×100。

抑制率(%)=(CK2發(fā)病率-WD處理組發(fā)病率)/CK2發(fā)病率×100。

1.2.4 拮抗菌株不同生長(zhǎng)時(shí)期無(wú)菌發(fā)酵濾液的抑菌效果

根據(jù)拮抗菌株的生長(zhǎng)曲線，取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期、衰亡期3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，并將各時(shí)間點(diǎn)的菌液離心10 min(7 104g， 4 ℃)[16]并收集上清液，再用0.22 μm濾膜過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵濾液，將其與已滅菌且未完全凝固的PDA培養(yǎng)基按體積比2∶1混合搖勻，以NB培養(yǎng)基無(wú)菌濾液與已滅菌且未完全凝固的PDA培養(yǎng)基相同比例混合作為對(duì)照，混合液倒入平板(直徑90 mm)，待培養(yǎng)基凝固后在平板中央接入Fon菌碟(直徑8 mm)，30 ℃培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測(cè)量Fon菌落直徑，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，根據(jù)下面公式計(jì)算拮抗菌株不同時(shí)期無(wú)菌濾液的抑菌率[17]。

抑菌率/%=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。

1.2.5 拮抗菌株衰亡期無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性穩(wěn)定性

pH和溫度對(duì)無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。將無(wú)菌發(fā)酵濾液分別用1 mol·L-1HCl或0.5 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH至4、6、7、9、12，處理60 min，再將pH調(diào)回7。將經(jīng)不同pH處理的無(wú)菌發(fā)酵濾液在-20、0、30、60、121 ℃(高壓蒸汽滅菌)處理60 min，室溫平衡后測(cè)定無(wú)菌發(fā)酵濾液抗Fon的活性。

時(shí)間對(duì)無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。將發(fā)酵濾液于4 ℃下分別儲(chǔ)存1、3、5、10、20、30、45 d，測(cè)定抗Fon活性。

紫外線對(duì)無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。將4 mL無(wú)菌發(fā)酵濾液，紫外照射30、60、120 min，然后放置于暗處15 min。以未處理的無(wú)菌發(fā)酵濾液作為對(duì)照，檢測(cè)紫外線處理前后無(wú)菌發(fā)酵濾液抗Fon的活性。

1.2.6 拮抗菌株衰亡期無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon孢子形態(tài)的影響

挑取PDA平板上培養(yǎng)5 d的Fon于無(wú)菌水中，經(jīng)6層紗布過(guò)濾去除菌絲，在4 ℃，7 104g離心5 min并收集孢子，加入適量無(wú)菌水制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸液的濃度，并將孢子懸液的濃度調(diào)至106mL-1。拮抗菌株衰亡期的無(wú)菌發(fā)酵濾液與Fon孢子懸液按體積比1∶1混合，混合液置于30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)12 h，以同等條件下未加WD的NB培養(yǎng)基無(wú)菌濾液與Fon孢子懸液按體積比1∶1比例混合作為對(duì)照。分別吸取混合液滴在錫箔紙上風(fēng)干，4 ℃ 2.5%戊二醛溶液固定并保存4 h以上。再用pH 7.2的磷酸緩沖液將其固定，沖洗2次，依次將樣品置于體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%、100%乙醇中脫水置換，每級(jí)脫水時(shí)間為10～15 min，用100%乙醇置換時(shí)需加無(wú)水硫酸銅脫水10～15 min，再置于冷凍室固化12 h，每組3個(gè)平行試驗(yàn)，樣品通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM， S-3400， Hitachi， Japan)觀察并分析其形態(tài)變化[18]。

1.2.7 拮抗菌株衰亡期無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon膜完整性的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SYTO-9熒光染液可使死細(xì)胞和活細(xì)胞染色，而碘化丙啶(propidium iodide，PI)只能使膜受損的細(xì)胞染色，這2種染料同時(shí)出現(xiàn)時(shí)會(huì)降低SYTO-9的熒光。因此，具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞排斥PI僅被SYTO-9染色且發(fā)出綠色的熒光，而細(xì)胞膜受損的細(xì)胞被PI染色發(fā)出紅色熒光[19]。將拮抗菌株衰亡期的無(wú)菌發(fā)酵濾液與Fon孢子懸液按體積比1∶1比例混合，混合液在30 ℃下培養(yǎng)12 h后離心5 min(7 104g，4 ℃)，棄上清液留沉淀。以同等條件未加WD的NB培養(yǎng)基無(wú)菌濾液與Fon孢子懸液按體積比1∶1比例混合作為對(duì)照。使用LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒L7012(MA，USA)進(jìn)行常溫避光染色30 min，然后離心5 min(7 104g，4 ℃)，棄上清液留沉淀，加1 mL無(wú)菌水重復(fù)洗滌3次。再加1 mL無(wú)菌水于離心管中，搖晃均勻后取適量溶液于載玻片上制片，自然晾干，通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM， TCS SP8， Leica， Germany)觀察并分析其顏色變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010、SigmaPlot和SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選分離與鑒定

如圖1所示，平板對(duì)峙法表明菌株WD對(duì)Fon有拮抗作用(圖1-A)，WD菌落在NA培養(yǎng)基上呈米白色、不透明、有褶皺分布；光學(xué)顯微鏡下觀察菌體為有芽孢的短桿狀(圖1-B)。根據(jù)16S rDNA的測(cè)序結(jié)果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，并采用MEGA5.0軟件構(gòu)建菌株WD的16S rDNA(圖1-C)、gyrA(圖1-D)和gyrB(圖1-E)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)菌株WD與BacillusamyloliquefaciensNDS7(KX871898.1)的相似度為100%，16S rDNA序列分析結(jié)果可將菌株WD確定為芽孢桿菌屬。以菌株WD的gyrA和gyrB序列與文獻(xiàn)報(bào)道的模式菌株gyrA和gyrB序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)菌株WD與Bacillusamyloliquefaciensstrain (CP017953.1)和Bacillusamyloliquefaciensstrain (KP143083.1)親緣關(guān)系最近且遺傳距離相似。所以基于菌株的形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列分析，鑒定并將菌株命名為BacillusamyloliquefaciensWD。

2.2 Bacillus amyloliquefaciens WD菌液對(duì)西瓜枯萎病發(fā)病率的影響

幼苗培養(yǎng)45 d后，CK1、CK2、WD處理組植株發(fā)病率分別為5.88%、75.00%、31.82%(圖2)，未加菌的CK1植株長(zhǎng)勢(shì)良好，WD處理組西瓜枯萎病發(fā)病率明顯低于未經(jīng)處理的CK2，抑制率達(dá)到57.57 %，說(shuō)明BacillusamyloliquefaciensWD可有效抑制西瓜枯萎病的發(fā)生。

2.3 Bacillus amyloliquefaciens WD生長(zhǎng)曲線與抑菌效果

以菌株WD的D600為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制拮抗菌WD的生長(zhǎng)曲線。由圖3-A可知，其延滯期為0～4 h，4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，52 h后進(jìn)入衰亡期。在除延滯期以外的3個(gè)時(shí)期內(nèi)選取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：12、36、60 h。如圖3-B所示，WD菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12 h)無(wú)菌發(fā)酵濾液處理的Fon菌絲生長(zhǎng)直徑為45.54 mm，其抑菌率為24.59%；WD菌株平穩(wěn)期(36 h)無(wú)菌發(fā)酵濾液處理的Fon菌絲生長(zhǎng)直徑為30.74 mm，其抑菌率為49.24%；衰亡期(60 h)無(wú)菌發(fā)酵濾液處理的Fon菌絲生長(zhǎng)直徑為27.32 mm，抑菌率為54.32%。結(jié)果表明，BacillusamyloliquefaciensWD在衰亡期時(shí)無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌效果好。

圖1 菌株WD對(duì)Fon的拮抗性(A)、菌株WD形態(tài)學(xué)特征(B)和16S rDNA(C)、gyrA(D)、gyrB(E)基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 Bacillus amyloliquefaciens WD衰亡期無(wú)菌發(fā)酵濾液抗菌穩(wěn)定性

如圖4所示，隨溫度、pH升高發(fā)酵濾液抑菌先增后減的趨勢(shì)，30 ℃、pH 7時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率可達(dá)58.36%(圖4-A)；除121 ℃、pH 12抑菌率相對(duì)較低外，其他抑菌活性均較強(qiáng)，說(shuō)明WD無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)溫度、酸堿度的耐受穩(wěn)定性高。發(fā)酵濾液在4 ℃保存45 d內(nèi)抑菌活性變化較小，第1天抑菌率最低(33.04%)，第5天抑菌率最高(38.08%)(圖4-B)，說(shuō)明發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性受貯藏時(shí)間影響較小(圖4-B)。紫外線照射發(fā)酵濾液30、60、120 min后，菌絲直徑無(wú)顯著差異(圖4-C)，表明紫外光照處理120 min內(nèi)對(duì)WD無(wú)菌發(fā)酵濾液的抗菌活性沒(méi)有影響。

柱子上無(wú)相同小寫(xiě)字母表示不同處理差異顯著(P<0.05)；下同Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05 under different treatments. The same as below.

2.5 Bacillus amyloliquefaciens WD衰亡期無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon微觀形態(tài)的影響

如圖5所示，通過(guò)SEM觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照中Fon孢子粗細(xì)均一，表面光滑(圖5-A)，無(wú)菌發(fā)酵濾液處理12 h后，F(xiàn)on孢子表面粗糙且多處凹陷(圖5-B)。說(shuō)明WD無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon孢子形態(tài)有直接破壞作用，從而抑制Fon的生長(zhǎng)。

2.6 Bacillus amyloliquefaciens WD衰亡期無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon質(zhì)膜完整性的影響

圖3 菌株WD的生長(zhǎng)曲線和不同生長(zhǎng)時(shí)期無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon菌絲生長(zhǎng)的效果

圖4 菌株WD無(wú)菌發(fā)酵濾液抗Fon活性的穩(wěn)定性

圖5 菌株WD無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon孢子微觀形態(tài)的影響

如圖6所示，通過(guò)CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照Fon孢子發(fā)出綠色熒光(圖6-A)，WD無(wú)菌發(fā)酵濾液處理12 h后的Fon孢子(圖6-B)部分發(fā)出紅色熒光和黃色熒光(圖6-C)，說(shuō)明WD無(wú)菌發(fā)酵濾液使一部分Fon細(xì)胞膜受到不同程度的損傷甚至引起細(xì)胞死亡。

圖6 菌株WD無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon質(zhì)膜完整性的影響

3 討論

Bacillusamyloliquefaciens是芽孢桿菌屬的重要菌種，它不僅對(duì)植物生長(zhǎng)有良好的促進(jìn)作用，而且對(duì)植物根部病害具有很好的生物防控效果[20]，越來(lái)越受到研究人員的關(guān)注。生防菌株的防治能力在環(huán)境中受多因素影響，經(jīng)平板對(duì)峙法篩選出的高效拮抗菌株不能確保為最優(yōu)的實(shí)用菌株，在植株根部的定殖能力決定其在實(shí)際應(yīng)用中的生防效果[21]。本文經(jīng)平板對(duì)峙和盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，B.amyloliquefaciensWD對(duì)西瓜枯萎病菌有較強(qiáng)的抑制作用，能顯著降低西瓜枯萎病的發(fā)生，推測(cè)該菌株有較好的定殖能力，且衰亡期的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)Fon菌絲生長(zhǎng)抑制率高達(dá)54.32%，優(yōu)于B.amyloliquefaciensB6對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制效果[22]。B.amyloliquefaciens在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)，如環(huán)脂肽、表面活性素、芬枯草菌素、聚酮化合物、芽孢霉菌素、地非西丁等，這些物質(zhì)的活性受環(huán)境影響很大[23-24]。本研究中WD發(fā)酵濾液對(duì)溫度、pH的耐受性較強(qiáng)；4 ℃貯存45 d、紫外光照處理120 min對(duì)WD發(fā)酵濾液的抑菌活性無(wú)影響，說(shuō)明其發(fā)酵濾液抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性較強(qiáng)，且適合長(zhǎng)期保存。這一結(jié)果為其實(shí)際應(yīng)用和后續(xù)功能物質(zhì)的分離純化提供了依據(jù)。

芽孢桿菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期分泌的抗菌物質(zhì)或次生代謝物質(zhì)不同[25]，本研究中，WD衰亡期的無(wú)菌發(fā)酵濾液較對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平穩(wěn)期的抑菌活性高，初步推測(cè)該菌株主要在衰亡期分泌抗菌物質(zhì)。張學(xué)雯等[26]發(fā)現(xiàn)，B.amyloliquefaciensB10-6-1產(chǎn)生的脂肽類抗生素C14 Bacillocnycin D和C15 Bacillocnycin D可以有效抑制黃曲霉。茍艷等[27]研究表明，解淀粉芽孢桿菌MY001分泌的殼聚糖酶和幾丁質(zhì)酶對(duì)幾丁質(zhì)的降解和蘆筍莖枯病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，而WD發(fā)酵液中的抑菌功能物質(zhì)究竟是什么，需下一步借助高效液相色譜、高分辨質(zhì)譜手段并結(jié)合基因組測(cè)序明確其功能物質(zhì)的成分與結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)道，多數(shù)抗菌物質(zhì)的靶標(biāo)是病原菌細(xì)胞膜，溶解細(xì)胞膜導(dǎo)致病原菌死亡[28]，Li等[29]發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)直接與病原菌細(xì)胞膜作用，增強(qiáng)膜的滲透性引起細(xì)胞死亡。本研究SEM與CLSM結(jié)果表明，WD無(wú)菌發(fā)酵濾液可使Fon孢子表面凹陷，破壞細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞死亡。這可能是體外試驗(yàn)中WD抑制Fon生長(zhǎng)的原因之一。B.amyloliquefaciens的抑菌機(jī)制還包括抑制病原菌線粒體的呼吸鏈[30]、抑制核酸生物合成[31]和干擾病原菌金屬離子的運(yùn)輸[32]等。WD抑制Fon的深層機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。綜上所述，由青昕蔬菜基地作物根際土壤中篩選到的拮抗菌株BacillusamyloliquefaciensWD及其無(wú)菌發(fā)酵濾液有較好的抑菌效果，為西瓜枯萎病生防菌劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。