“腸康方”對IBS-D大鼠腸組織中SERT、5-HT3受體的影響

樊欣鈺，陸敏,任杰

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是胃腸功能紊亂的一種腹痛伴隨著排便或者其他腸道習(xí)慣改變的綜合征[1-2]。腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)是其最常見的一個亞型。目前，尚未有權(quán)威機構(gòu)對其發(fā)病原因及發(fā)病機制做出明確解釋，也未有明確療效的治療藥物，只知其可能與內(nèi)臟的敏感性增高、腦-腸軸的功能異常、消化道微生物的紊亂、胃腸道動力學(xué)的異常、精神心理等有關(guān)。近年來，隨著研究的深入，針對IBS的治療已經(jīng)從針對胃腸道自身的治療上升為針對與其相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)，即羅馬IV所指出的腦-腸軸調(diào)控系統(tǒng)，同時將精神心理等因素納入研究范圍，從局部逐漸向整體入手，中醫(yī)優(yōu)勢更為凸顯。

5-HT3受體，作為5-羥色胺(serotonin，5-HT)受體的亞型之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸神經(jīng)系統(tǒng)周邊出現(xiàn)的配體門控離子通道，可同時調(diào)節(jié)興奮性和抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的傳遞。5-HT參與調(diào)節(jié)消化道感覺、運動和分泌功能，在神經(jīng)突觸間隙與突出后膜5-HT3受體結(jié)合后迅速分離后，大部分被突觸前膜的受體再次攝取回收、儲存[3]。5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，SERT)是對5-HT有高度親和力的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，能夠重新攝取細(xì)胞間隙內(nèi)的5-HT，從而起到滅活5-HT的作用，影響胃腸道的運動，引起腹痛、腹瀉等臨床癥狀。

近年來，中醫(yī)藥在治療IBS方面取得了良好的治療效果，并且毒副作用低，其開發(fā)前景。本研究采用名醫(yī)驗方“腸康方”干預(yù)內(nèi)臟高敏感IBS-D模型大鼠(番瀉葉疊加束縛刺激法)，解析其中藥復(fù)方的多成分多靶點的的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，挖掘并傳承名老中醫(yī)驗方。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

成年健康清潔級Wistar大鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(上海)2013-0016)，在江蘇省中醫(yī)藥研究院SPF級實驗動物中心喂養(yǎng)，許可證號：SYXK(蘇)2016-0018，環(huán)境溫度(23±3)℃，濕度(55±5)%，自然光照，自由進(jìn)食。

1.2 實驗藥物

番瀉葉、白芍、防風(fēng)、熟地黃、菟絲子、黃連、金蕎麥、蟬蛻，由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。

匹維溴銨片，生產(chǎn)廠家：Abbott Products SAS，規(guī)格：每片50 mg，批號：H20120127。

1.3 實驗試劑及儀器

水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木精-伊紅染色液，武漢Boster生物工程有限公司；10%甲醛，西隴化工股份有限公司；Anti-ACTH抗體，英國Abcam公司(ab74976)；Anti-VIP抗體，英國Abcam公司(ab22736)；Anti-Substance P抗體，英國Abcam公司(SP-DE4-21)。

石蠟切片機，德國zeiss公司Microm-340E；組織脫水機，英國shandon公司Hypercenter-xp；組織包埋機，英國shandon公司Histocentre-2；電子顯微鏡，Olympus公司；電子秤，上海浦春計量儀器有限公司；Image Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)；Logene PA9000病理圖像分析系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 IBS-D模型建立

造模組造模：參考[4]造模方法，番瀉葉5倍體積的開水中浸泡一夜取濾液，濃縮至濃度為0.3 g/mL，灌胃體積為10 mL/kg，1次/日，在番瀉葉水灌胃1 h后用自制容器及繃帶束縛大鼠的四肢，限制大鼠運動的同時產(chǎn)生一定的刺激，束縛大鼠使得其煩躁不安，持續(xù)2 h，持續(xù)2周?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不采取任何措施。

2.2 模型評價

大鼠一般情況：造模期間精神狀態(tài)、活動、大鼠毛發(fā)、食欲、體質(zhì)量和糞便等。腹壁撤退反射評分(abdominal withdrawal reflex,AWR)；結(jié)腸組織病理學(xué)檢查：空白組及模型組分別隨機選取雌雄各1只。

2.3 動物分組與干預(yù)方法

采用隨機分組法將造模成功的大鼠分成5組，模型對照組、陽性藥物組、腸康方高劑量組(H-CKF)、腸康方中劑量組(M-CKF)和腸康方低劑量組(L-CKF)，每組10只。

將“腸康方”七味中藥飲片(白芍15 g，防風(fēng)6 g，熟地黃5 g，菟絲子5 g，金蕎麥8 g，黃連3 g，蟬蛻3 g)先加入10倍水中煎煮1.5 h，倒出煎液再加入8倍體積的水中煎煮同樣時間，合并2次煎液濃縮，根據(jù)60 kg/200 g人鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)w=6.25計算等效劑量，配成0.47 g/mL、0.94 g/mL、1.88 g/mL藥液，給藥體積為2 mL/只。

陽性藥濃度：參照文獻(xiàn)[5]配成濃度為1.5 mg/mL的藥液，給藥體積為2 mL/只。

正常組及模型對照組予等體積蒸餾水。

給藥頻次：每日1次，固定在上午8:00～10:00點間，持續(xù)2周。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.4.1 一般情況

觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、飲食、活動和體質(zhì)量變化、排便情況等。

2.4.2 AWR評分

對各組大鼠造模后及藥物干預(yù)后進(jìn)行AWR評分。具體操作如下[6]：操作前禁食不禁水12 h，操作時將大鼠放入玻璃容器(自制)中，限制其運動，使其只能前后運動。先將2 mL注射器連接到血壓計上，向血壓計中注氣，分別記下10、20、40、60、80 mmHg所對應(yīng)的刻度，探后將注射器連接到8F導(dǎo)尿管。由注射器向?qū)蚬苤凶?，并達(dá)到相應(yīng)的刻度，表示導(dǎo)尿管前端球囊內(nèi)的壓力為相應(yīng)的壓強。將導(dǎo)尿管(型號：8F)自肛門插入，待球囊末端伸入肛門約1 cm。待大鼠平穩(wěn)安靜后，向?qū)蚬軆?nèi)注氣，使球囊內(nèi)壓強分別為10、20、40、60、80 mmHg。每個壓強分別持續(xù)20 s，觀察大鼠在各個壓強下的反應(yīng)，對其進(jìn)行半定量評分。每個壓力下重復(fù)3次并評分，取其平均值并記錄。

評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]，按照刺激大鼠時的表現(xiàn)評分：0分，無行為反應(yīng)；1分，僅頭部短暫運動，身體不動；2分，腹部肌肉收縮，但未抬離底面；3分，腹肌收縮并抬離底面；4分，骨盆抬起，身體呈弓形。

2.4.3 5-HT3受體及5-HT轉(zhuǎn)運體平均光密度值

處死動物后，取全腦和近直腸端約1 cm結(jié)腸，固定在甲醛中，石蠟包埋，切片后行免疫組化染色。免疫組化染色后，顯微鏡下觀察，每個標(biāo)本隨機選取5個視野，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性反應(yīng)，無棕黃染色為陰性，每個視野利用拍攝器截取圖像。應(yīng)用Image Pro Plus 軟件測定其陽性表達(dá)的光密度(optical density,OD)值進(jìn)行半定量分析，取其平均值。以測定結(jié)腸組織中5-HT受體及轉(zhuǎn)運體水平。棕黃染色越多，OD值越大，5-HT受體及轉(zhuǎn)運體表達(dá)水平越高。

2.5 統(tǒng)計分析

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠一般情況觀察

空白組大鼠精神良好，毛色亮白，體型適中，活動敏捷，體質(zhì)量增長率25.22%，造模及藥物干預(yù)期間大便正常，造模后大便變軟，或成稀狀、稀水狀，隨著時間推移情況無明顯好轉(zhuǎn)。

模型組大鼠造模期間精神狀態(tài)較差，毛色干枯，隨著造模的繼續(xù)，發(fā)現(xiàn)大鼠活動、飲食、飲水較正常組都略有減少且喜抱聚成團(tuán)，體質(zhì)量無增加；予等體積蒸餾水2周后，體質(zhì)量增長率為10.19%。

陽性藥及各濃度腸康方干預(yù)大鼠組，造模期間及造模后狀態(tài)同模型對照組；藥物干預(yù)后，各組間大鼠差異不明顯，均表現(xiàn)出精神轉(zhuǎn)好，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光亮，飲食、活動均增多，詳見圖1，各組增長率分別為17.14%、25.54%、29.69%、23.38%，藥物干預(yù)后，腹瀉逐漸消失，大便逐漸恢復(fù)正常。

A：空白組；B：模型對照組；C：陽性藥組；D：腸康方高劑量組；E：腸康方中劑量組；F：腸康方低劑量組圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

3.2 IBS-D大鼠造模情況

造模期間死亡3只，其中1只為束縛捆綁時死亡，分析與捆綁時姿勢、力度不當(dāng)相關(guān)；另2只死亡，考慮因灌胃技術(shù)或飲食減少等導(dǎo)致。給藥期間，各組大鼠均無死亡。

在觀察大鼠一般情況、排便情況的同時，結(jié)合AWR評分和結(jié)腸粘膜組織形態(tài)學(xué)觀察，判斷大鼠造模成功率，各組大鼠造模情況如表1所示。分別選取空白組、造模組雌雄各1只，共4只，觀察其腸粘膜組織形態(tài)，空白組為正常粘膜；造模組腸黏膜見灶性淋巴細(xì)胞、小膿腫，提示炎癥可能，如圖2所示。

表1 各組大鼠造模情況

3.3 AWR評分結(jié)果

造模結(jié)束后，與空白組相比，造模組大鼠在10、20、40、60、80 mmHg球囊壓力下的AWR的評分均顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示：模型組大鼠內(nèi)臟呈高敏感。結(jié)果見表2。

A、B：空白組；C、D：模型對照組圖2 造模后空白組和造模組腸黏膜組織

表2 造模后大鼠AWR評分

注：與空白組相比，*P<0.01

表3 大鼠AWR評分

注：與空白組相比，*P<0.01；與模型對照組相比，##P<0.05，#P<0.01

藥物干預(yù)結(jié)束后，與模型對照組相比，腸康方高中低劑量組及陽性藥組大鼠在各壓力下的AWR評分均下降。同時在10、20、40、60 mmHg球囊壓力下，各組AWR評分均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在80 mmHg壓力下，陽性藥組、腸康方高劑量組、腸康方低劑量組AWR評分低于模型對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示：藥物干預(yù)組大鼠內(nèi)臟高敏感均有所減輕。見表3。

3.4 5-HT3受體及5-HT轉(zhuǎn)運體的表達(dá)

與空白組相比，模型對照組大鼠腸組織中5-HT3R棕黃染色陽性表達(dá)細(xì)胞分布相對較密集，光密度OD值升高；SERT棕黃染色陽性表達(dá)細(xì)胞分布相對較分散，光密度OD值降低。

藥物干預(yù)結(jié)束后，腸康方高中低劑量組、陽性藥組大鼠腸組織中5-HT3R較模型對照組光密度OD值均降低， SERT光密度OD值均升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但在各濃度之間未見明顯相關(guān)性；

提示：腸康方高中低劑量組、陽性藥物組均能夠降低IBS-D模型大鼠腸組織中5-HT3R的表達(dá)，腸康方高中低劑量組、陽性藥物組均能夠升高IBS-D模型大鼠腸組織中SERT的表達(dá)，見表4。

表4 各組大鼠腸組織中5-HT3受體及5-HT轉(zhuǎn)運體光密度值

注：與模型對照組相比，*P<0.01，**P<0.05

顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果，可見所有切片中均可見多少不等的5-HT3R、SERT陽性表達(dá)的細(xì)胞，陽性細(xì)胞大多為圓形或橢圓形，有棕黃色顆粒。圖3顯示模型對照組較空白組比棕黃染色顆粒明顯增多；給藥后與模型對照組相比，陽性藥組、腸康方高中低劑量組陽性表達(dá)顆粒明顯減少。圖4顯示與空白組比較，模型對照組陽性表達(dá)細(xì)胞明顯減少，各給藥組陽性表達(dá)細(xì)胞增多。

4 討論

IBS的病理機制目前尚未完全明確，涉及內(nèi)臟高敏感、腦-腸軸異常、消化道感染、胃腸動力異常以及精神心理等多方面。近年來，隨著羅馬Ⅳ的出臺人們越來越關(guān)注“腦-腸軸學(xué)說”，認(rèn)為IBS發(fā)病與神經(jīng)免疫內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控不平衡相關(guān)，大腦接收來自胃腸道的持續(xù)內(nèi)感受輸入信號，將這些信號與來自身體的其他內(nèi)感受信號相互整合，向胃腸道內(nèi)的各種靶細(xì)胞發(fā)送。

IBS-D治療的目標(biāo)是緩解癥狀和改善生活質(zhì)量，目前西醫(yī)治療以對癥治療為主。中醫(yī)在IBS-D的治療方面具有較好的療效，近年來，IBS-D已成為中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢病種之一。名老中醫(yī)驗方“腸康方”，前期在臨床反饋療效較好，已獲得國家發(fā)明專利和藥物臨床批件，方中重用白芍養(yǎng)血柔肝、收斂肝氣、減少腸蠕動，防風(fēng)入肝疏肝氣、化水濕、疏脾止瀉，兩藥共用，木能疏土，健脾調(diào)肝，共為君藥。臣用熟地、菟絲子補腎陰腎陽，補腎火溫脾胃，而黃連清心降火，三藥同用，則心腎交通，情志得遂。金蕎麥、蟬蛻為佐藥，金蕎麥清肺熱，肺合大腸，肺降則腸安；蟬蛻入肝經(jīng)入肺經(jīng)，消風(fēng)解痙，減輕腸道痙攣。全方調(diào)和肝脾、交通心腎、緩?fù)粗篂a、寧神暢情?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白芍內(nèi)的主要活性成分白芍總苷可通過阻斷信號通路、抑制免疫細(xì)胞等方式緩解炎癥反應(yīng)[8-9]，減緩疼痛[10-12]；劉振清等將大鼠結(jié)腸平滑肌分離，通過對照試驗觀察防風(fēng)其收縮運動的影響發(fā)現(xiàn)防風(fēng)能夠抑制其平滑肌收縮[13]。熟地黃首載于《本草圖經(jīng)》，作用于人體可增加人體免疫力，具有抗腫瘤、促進(jìn)血液再生、抑制機體衰老等效果[14]。菟絲子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其可以調(diào)節(jié)免疫、抗衰老保護(hù)生殖系統(tǒng)、調(diào)節(jié)代謝和內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)心血管、營養(yǎng)神經(jīng)、改善記憶、抗疲勞等作用[15]。黃連其主要有效成分小檗堿、黃連堿等能夠廣譜抗菌，并且具有緩解炎癥、清熱、抗細(xì)菌毒素、治療腹瀉、抗病原體、抑制腫瘤等藥理作用[16]。范萬里發(fā)現(xiàn)，金蕎麥提取物可降低其血清炎癥水平[17]。蟬蛻首載于《名醫(yī)別錄》[18]，具有抗腫瘤和解熱鎮(zhèn)痛的效果[19]。本實驗選擇的陽性藥為“匹維溴銨”，選擇性腸平滑肌鈣離子拮抗劑，能夠緩解患者腹痛以及整體癥狀，是《中國腸易激綜合征專家共識意見(2015)》推薦的臨床常用藥物，國際上多個指南與共識意見也將其列為一線藥物[20-21]。實際應(yīng)用中也有諸多報道[22-24]顯示選用匹維溴銨對腹痛、腹部不適、腹瀉和IBS-D其他癥狀有顯著改善。

A：空白組； B：模型對照組； C：陽性藥組； D：腸康方高劑量組；E：腸康方中劑量組； F：腸康方低劑量組圖3 各組大鼠腸組織5-HT3結(jié)果(免疫組化染色，×200)

A：空白組； B：模型對照組； C：陽性藥組； D：腸康方高劑量組；E：腸康方中劑量組； F：腸康方低劑量組圖4 各組大鼠腸組織SERT結(jié)果(免疫組化染色，×200)

本研究運用改良后的造模方法，來構(gòu)建IBS-D大鼠模型。研究觀察顯示“腸康方”能夠明顯改善IBS-D模型大鼠的腹瀉癥狀，能夠明顯降低其AWR評分(P<0.05)，改善腸道高敏感。5-HT3受體是一個五聚體復(fù)合體，由不同亞基組合而成的受體亞型對5-HT的反應(yīng)可能不同[25-26]，廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞。5-HT通過5-HT3受體誘導(dǎo)腸易激綜合征的內(nèi)臟痛覺和超敏反應(yīng)。5-HT3受體促使平滑肌收縮，并通過刺激神經(jīng)末梢乙酰膽堿的釋放增加腸道分泌[27]。腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜釋放5-HT與腹痛或不適的嚴(yán)重程度相關(guān)。此外，體外研究表明，腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜上清可提高大鼠腸系膜感覺神經(jīng)元的激活率，5-HT3受體拮抗劑格拉司瓊可使刺激作用減弱[28]。本研究中模型組大鼠較空白組大鼠5-HT3受體表達(dá)明顯增多(P<0.01)；匹維溴銨陽性對照組及“腸康方”高中低劑量組均可降低5-HT3受體OD值表達(dá)(P<0.05)。

藥理研究[29-30]和臨床研究[31-32]表明5-HT3受體拮抗劑是IBS患者的有效治療手段，內(nèi)源性5-HT失活的另一種方法依賴于內(nèi)源性生物胺的SERT。Gershon的小組通過一系列研究證明了SERT的功能作用。首先，他們證明了藥物5-羥色胺再攝取抑制劑抑制黏膜5-HT攝取，導(dǎo)致黏膜下神經(jīng)元對黏膜刺激反應(yīng)增強。第二，豚鼠絨毛上皮細(xì)胞失活5-HT釋放腸內(nèi)分泌細(xì)胞對黏膜刺激的反應(yīng)。上皮細(xì)胞表達(dá)SERT導(dǎo)致上皮細(xì)胞重新攝取5-HT，終止其對黏膜中的作用。第三，在轉(zhuǎn)基因小鼠中靶向刪除編碼SERT的基因會導(dǎo)致小鼠便秘和腹瀉之間腸道習(xí)慣的改變。這種轉(zhuǎn)運蛋白可以很好地調(diào)節(jié)大腦5-HT的神經(jīng)傳遞，在大腦皮層和邊緣區(qū)域有大量存在，這些區(qū)域與行為的情感方面有關(guān)。所以結(jié)合本實驗研究結(jié)果顯示，腸康方高中低劑量組、陽性藥物組均能夠升高IBS-D模型大鼠腸組織中SERT的表達(dá)(P<0.05)，從而起到緩解腸易激綜合征腹痛腹瀉等腸道癥狀。

綜上所述，“腸康方”能夠明顯改善IBS-D模型大鼠癥狀，改善其腸道高敏感狀態(tài)，明顯減少模型大鼠結(jié)腸組織中的5-HT3受體的表達(dá)、增強SERT的表達(dá)，同時，“番瀉葉灌胃+束縛刺激”的疊加復(fù)合因素造模方法可成功復(fù)制IBS-D大鼠模型，較好的模擬IBS-D的生物學(xué)特征。此外，天然藥物“腸康方”相較西藥匹維溴銨更具有副作用小、安全有效的優(yōu)勢。