PD-L1表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)及預后的關系

李玉玲 毛 尊 鞏玉森

乳腺癌(breast cancer ，BC)是女性最常見惡性腫瘤之一，長期以來被認為較黑色素瘤及腎惡性腫瘤具有較低的免疫原性[1]。實際上，乳腺癌是一種多基因參與的高度異質(zhì)性腫瘤。同時，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌具有免疫作用，其中ER陰性、高度增殖性乳腺癌具有較高免疫原性[2,3]。近年來，癌癥免疫治療領域取得巨大進展，特別是免疫檢查點抑制劑的開發(fā)，如ipilumumab、細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic lymphocyte- associated antigen-4 ，CTLA-4)和程序性死亡受體-1(programmed cell death 1，PD-1)/程序性死亡配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)軸抑制劑[4]。其中PD-1/PD-L1軸被認為是乳腺癌免疫治療中最有希望的靶點。PD-1是由多種免疫細胞(如T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞等)表達的細胞表面膜蛋白，與其配體PD-L1和(或)PD-L2結合后，抑制淋巴細胞激活，促進調(diào)節(jié)性T細胞的活化，從而抑制免疫應答[5～7]。在癌癥中是腫瘤細胞免疫逃逸的共同機制。PD-L1 在多種腫瘤組織微環(huán)境內(nèi)上調(diào)，能夠使癌癥相關免疫細胞發(fā)生凋亡，減弱其免疫原性，參與癌癥的免疫逃逸過程。PD-1/PD-L1抑制劑的臨床試驗顯示出非常有希望的效果和持久的反應性，特別是在黑色素瘤、肺癌和膀胱癌中[4,8]。此外，PD-L1表達與治療客觀反應之間具有相關性[8]。至于PD-L1作為免疫治療預測標志物的研究在乳腺癌中仍然較少，因此探索PD-L1在乳腺癌組織的表達具有一定的必要性。本研究采用免疫組化SP法判斷PD-L1在乳腺癌組織微陣列(TMA)上的表達，并分析PD-L1表達與患者臨床病理參數(shù)及生存預后的關系。

資料與方法

1.臨床資料:收集2010年4月～2016年5月徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院乳腺癌石蠟標本217例，選擇腫瘤組織的核心區(qū)域構建TMA。217例患者的平均年齡為50.0±10.7歲，范圍為26～80歲；腫瘤最大直徑0.6～7.2cm，平均直徑為2.79±1.40cm；腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移93例，無淋巴結轉(zhuǎn)移124例；根據(jù)《WHO乳腺腫瘤分類》內(nèi)改良Scarff-Bloom-Richardson分級系統(tǒng)，判斷腫瘤組織分化程度，SBR 1級9例，2級148例，3級60例；根據(jù)ER、PR、HER-2和Ki67的表達比率，將乳腺癌分為4組分子亞型，Luminal A 型13例，Luminal B型 81例，HER-2過表達型60例，TNBC型63例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)及美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)乳腺癌TNM分期方法，Ⅰ+Ⅱ期183例， Ⅲ+Ⅳ期34例。

2.TMA的建立:TMA使用最具代表性的區(qū)域構建，其中單個病例具有一個重復。所有腫瘤組織核心區(qū)域的選擇均由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生對組織切片進行評估后決定。兩名病理醫(yī)生在同一病例中核心區(qū)域選擇的差異通過聯(lián)合分析解決。從每個乳腺癌病例石蠟切片形態(tài)學上具有代表性的區(qū)域(腫瘤內(nèi)核心)沖壓出直徑0.6mm的組織圓柱體，并使用半自動化組織塊將其帶入一個空白石蠟(2.5～3.0cm)中。

3.免疫組化:采用免疫組化SP法進行染色，4μm切片的TMA組織經(jīng)檸檬酸鈉溶液熱誘導抗原修復后，過氧化氫阻止內(nèi)源性過氧化物酶表達，超級封閉液減少一抗非特異性結合，滴加預稀釋的PD-L1 (E1L3N)單克隆抗體(兔抗人，1∶400，美國CST公司)37℃溫箱孵育1h。滴加酶標二抗聚合物37℃溫箱孵育20min。使用標準DAB技術進行免疫染色。用蘇木精溶液進行復染。PD-L1的結果判讀:①部分或完整細胞膜染色(≥1+)的腫瘤細胞占全部腫瘤細胞<1%，為PD-L1陰性；②部分或完整細胞膜染色(≥1+)的腫瘤細胞占全部腫瘤細胞≥1%，為PD-L1陽性。Ki67以20%為截點，判斷表達高低。

4.隨訪:217例乳腺癌患者中有209例具有完整臨床隨訪信息，隨訪時間為1～100個月，中位隨訪時間63個月，其中死亡24例，轉(zhuǎn)移或復發(fā)44例，生存(截尾數(shù)據(jù))8例?？傮w存活(overall survival,OS)：是第1次確診開始到任何原因引起患者死亡的時間(失訪為最后一次隨訪時間；仍然存活為隨訪結束時間)。無病存活(disease free survival,DFS)：是第1次確診到患者發(fā)生復發(fā)/轉(zhuǎn)移的時間(失訪為最后一次隨訪時間；仍然存活為隨訪結束時間)。

5.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。使用χ2檢驗及Fisher精確檢驗分析PD-L1表達與臨床病理參數(shù)之間的關系。使用Kaplan-Meier方法和對數(shù)秩檢驗來計算OS和DFS比率并比較存活曲線之間的差異。使用單因子COX比例風險模型識別與乳腺癌OS和DFS顯著相關的因子，多變量COX模型評估了PD-L1表達與其他因子之間的雙向相互作用,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.乳腺癌臨床病理特征:關于腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及血管侵犯的結果顯示分別有42.9%(93/217)、17.1%(37/217)和21.2%(46/217)的陽性病例。SBR分類結果顯示只有4.2%(9/217)為Ⅰ級，95.8%(208/217)為Ⅱ級及Ⅲ級[分別為68.2%(148/217)和27.6%(60/217)]。基于免疫組織化學染色，ER、PR和HER-2陽性率分別為30.4%(66/217)、37.3%(81/217)和42.9%(93/217)。同時評估了Ki67的表達情況，71.0%(154/217)患者Ki67高表達，29.0%(63/217)低表達。分子分型結果顯示Luminal B型是最常見，占總體的37.3%(81/217)，其次是TNBC型為29.0%(63/217,表1)。

2.PD-L1表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關系:PD-L1陽性表達主要定位于腫瘤細胞的細胞膜或細胞質(zhì)(圖1)。217例可評估原發(fā)性乳腺癌組織構成的TMA中，PD-L1陽性率為14.7%(32/217)，PD-L1在乳腺癌分子亞型中陽性率,以TNBC型最高，為30.2%(19/63)，其次HER-2過表達型13.3%(8/60)，Luminal A型 7.7%(1/13)和Luminal B型4.9%(4/81)，且PD-L1表達與分子分型比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達與患者的年齡、腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、血管侵犯及TNM分期比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而與腫瘤的直徑、組織分化程度、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、HER-2狀態(tài)和Ki67高表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 PD-L1與217例乳腺癌臨床病理參數(shù)的關系

圖1 PD-L1在乳腺癌組織微陣列上的表達A.PD-L1在胎盤(陽性對照)中的表達(SP，×20)；B.PD-L1在乳腺癌弱陽性表達(SP，×20)；C.PD-L1在乳腺癌強陽性表達(SP，×40)

3.PD-L1表達與乳腺癌患者生存的關系:Kaplan-Meier結果顯示，PD-L1陽性乳腺癌及TNBC患者的OS及DFS時間長于PD-L1陰性患者，但Log-Rank檢驗結果表明PD-L1表達與乳腺癌OS及DFS無關(OS:χ2=2.313，P=0.128；DFS:χ2=2.345，P=0.126,圖2),而與TNBC患者更好的OS及DFS相關(OS:χ2=5.771，P=0.016；DFS:χ2=5.783，P=0.016,圖3)。使用COX比例風險回歸模型單變量分析結果顯示，淋巴結轉(zhuǎn)移與乳腺癌及TNBC患者的OS及DFS有關；ER、PR狀態(tài)與乳腺癌患者OS及DFS有關，TNM分期與乳腺癌患者DFS有關，PD-L1與TNBC患者的OS及DFS有關(P<0.05)，進一步進行COX比例風險回歸模型多變量分析顯示，PD-L1陽性仍然可作為判斷TNBC患者預后的獨立指標，PR狀態(tài)是判斷乳腺癌患者預后的獨立指標，而淋巴結在乳腺癌及TNBC患者中均為獨立的預后指標(表2～表5)。

圖2 乳腺癌患者預后的Kaplan-Meier曲線A.PD-L1陽性患者OS(P=0.128);B.PD-L1陽性患者的DFS(P=0.126)

圖3 TNBC患者預后的Kaplan-Meier曲線A.PD-L1陽性患者的OS(P=0.016);B.PD-L1陽性患者的DFS(P=0.016)

討 論

PD-L1是I型跨膜蛋白，在小鼠和人抗原呈遞細胞，非造血細胞和非淋巴器官如心臟、肺、胎盤和肝臟中組成型表達，并在多種惡性腫瘤微環(huán)境中上調(diào)，如結腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌和食管鱗狀細胞癌[9～12]。PD-L1與PD-1相互作用，導致T細胞活化和增殖降低，抑制抗細胞凋亡分子Bcl-xl的表達和促進炎性細胞因子的產(chǎn)生，使癌癥相關免疫細胞發(fā)生凋亡，減弱其免疫原性，從而抑制免疫應答，這種機制可以使癌細胞逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視，介導疾病進展[5,6]。

表2 乳腺癌OS單因素及多因素COX回歸分析

表3 乳腺癌DFS單因素及多因素COX回歸分析

表4 TNBC OS單因素及多因素COX回歸分析

表5 TNBC DFS單因素及多因素COX回歸分析

本研究中乳腺癌患者PD-L1的陽性率為14.7%，在TNBC中，PD-L1表達上調(diào)，陽性率為30.2%。與 Sabatier等[13]對乳腺癌患者的研究相似(PD-L1在乳腺癌中的陽性率為20.0%，TNBC亞型為38.0%)。同時，Meta分析表明，乳腺癌PD-L1陽性率在0%～83%，大多數(shù)研究結果顯示PD-L1陽性率低于50%[13～16]。對于TNBC亞型PD-L1陽性率在5%～80%[16～18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達與腫瘤體積大、組織分化程度低、ER陰性、PR陰性、HER-2陽性、Ki67高表達及分子分型等預后不良病理特征相關，提示PD-L1是腫瘤侵襲性較高的指標。Bae等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1表達與組織分化程度低、無淋巴結轉(zhuǎn)移、ER陰性、PR陰性、HER-2陽性及Ki67高表達相關。Qin等[15]發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達與腫瘤體積大、血管侵犯、組織分化程度低、淋巴結轉(zhuǎn)移以及ER陰性、PR陰性和HER-2陽性相關。此外，Chen等[12]在食管鱗狀細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達并與腫瘤的部位、組織分化程度低、臨床分期晚及淋巴結轉(zhuǎn)移等相關,需要進一步研究其相關分子機制。與既往乳腺癌研究結果略有不同，筆者觀察到PD-L1表達患者術后OS及DFS時間較無PD-L1表達的患者更長，但與患者OS及DFS無關。而在TNBC亞型，PD-L1表達與患者OS及DFS相關，且為其獨立預后因素[14～17]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結轉(zhuǎn)移為乳腺癌及TNBC亞型的獨立預后指標，PR為乳腺癌的獨立預后指標。鑒于PD-L1的免疫抑制功能，與本研究中PD-L1上調(diào)是獨立的有利預后及預測因素似乎是矛盾的，生物學解釋可能是PD-L1表達是強細胞毒性局部免疫反應的標志物，本身是一種有利的預后和預測特征,在其他腫瘤內(nèi)也發(fā)現(xiàn)相似結果[10～12]。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌PD-L1表達患者OS及DFS長于PD-L1陰性患者。PD-L1表達也與高級別漿液性癌及肺鱗癌更好的生存預后相關[10，11]。

在乳腺癌研究中，Tsang等[16]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達既不與整體OS相關，也不與DFS相關；在TNBC亞型，PD-L1表達與患者OS和DFS相關。Qin等[15]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達與乳腺癌患者較差的DFS和OS有關，且PD-L1是其獨立預后因素。Botti等[17]研究發(fā)現(xiàn)在TNBC亞型中PD-L1表達與DFS密切相關，但與OS無關。Sabatier等[13]發(fā)現(xiàn)PD-L1表達與TNBC患者OS及DFS相關。Bae等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1的表達與DFS和OS相關，但不是其獨立的預后指標。這些研究結果的差異，通常是由于PD-L1 免疫組織化學染色結果的判斷缺乏共識(如細胞膜與細胞質(zhì)、染色強度、僅計數(shù)陽性腫瘤細胞或者還包括其他陽性細胞類型)，以及個人對最佳陽性截點的定義和解釋的主觀性造成。另外，腫瘤組織分析方法的差異(研究采用全組織切片、TMA或活檢標本)也會引起結果不同。Wimberly等[19]研究發(fā)現(xiàn)，同一乳腺癌患者的活檢標本，PD-L1的表達在視野之間變化可達4倍。其他器官腫瘤也表現(xiàn)出腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，例如肺癌之間的不一致性高達48%。在該領域的進一步研究，將有可能更好地理解PD-L1的表達及其對治療易感性和預后的影響。

綜上所述，PD-L1與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后具有一定相關性，在TNBC亞型中，PD-L1表達是其獨立的有利預后因素。根據(jù)PD-L1在腫瘤組織內(nèi)的表達特征，筆者推測其可能與患者臨床治療療效相關，并有可能指導未來的免疫治療策略。然而，由于目前PD-L1結果判斷尚無統(tǒng)一標準，故在PD-L1表達作為TNBC亞型可靠的生物學標志物之前仍有許多問題需要解決。