不同抗生素耐藥水平下幽門螺桿菌對(duì)黃連素的耐藥特性

陳 霞 夏晨梅 張忠臣 錢小棋 王雨銀 毛珺梁 湯清清

幽門螺桿菌(H.pylori)被認(rèn)為是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等多種疾病的主要病因，且根除H.pylori可顯著改善胃黏膜炎性反應(yīng)，促進(jìn)潰瘍愈合，降低胃癌發(fā)生率[1, 2]。菌株對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致H.pylori根除失敗的主要原因[3]。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，尤其是抗生素的不規(guī)范使用以及濫用，致使H.pylori對(duì)抗生素耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重。近年來(lái)我國(guó)H.pylori對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星及甲硝唑耐藥率呈上升趨勢(shì)，且H.pylori菌株對(duì)多種抗生素同時(shí)耐藥也越來(lái)越多，導(dǎo)致H.pylori根除率逐年下降[4]。因此，許多研究人員在不斷尋求理想的根治H.pylori方案。

眾所周知，大量抗生素的使用會(huì)破壞人體正常的腸道菌群，出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)。相對(duì)來(lái)說(shuō)，中藥毒性不良反應(yīng)小，且部分中藥提取物具有抗菌作用，對(duì)H.pylori具有抑制和殺滅作用[5, 6]。有研究表明，黃連素用于三聯(lián)、四聯(lián)方案有利于提高H.pylori根除率，還有不良反應(yīng)少、價(jià)格低廉、患者耐受性好等特點(diǎn)[7～9]。目前黃連素用于H.pylori根除治療的臨床研究開(kāi)展得較多，但體外黃連素對(duì)H.pylori的藥物敏感試驗(yàn)研究較少，本研究以臺(tái)州市溫嶺地區(qū)H.pylori菌株為研究對(duì)象，調(diào)查該地區(qū)H.pylori菌株對(duì)黃連素的耐藥率，為H.pylori根除治療的臨床用藥做指導(dǎo)。

材料與方法

1.研究對(duì)象：選取因胃部疾病至溫嶺市第一人民醫(yī)院就診的胃鏡檢查患者，于胃鏡下采集胃黏膜標(biāo)本1份，置于組織保存管中，低溫運(yùn)輸送檢。該研究已通過(guò)溫嶺市第一人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡30～55歲，男女不限；②呼氣試驗(yàn)結(jié)果為H.pylori陽(yáng)性；③近2周內(nèi)未使用抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑或 PPI 制劑。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；②妊娠或哺乳期女性；③有食管、胃腸手術(shù)史者；④患者不能正確表達(dá)自己的主訴，如精神病、嚴(yán)重神經(jīng)官能癥者；⑤患者同時(shí)服用非甾體抗炎藥或酗酒。

2.幽門螺桿菌分離培養(yǎng)：胃黏膜標(biāo)本經(jīng)過(guò)研磨后接種于含5%羊血的哥倫比亞培養(yǎng)基，37℃ 微需氧培養(yǎng)(5%O2、10%CO2、85%N2)2～3 天，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，經(jīng)生化反應(yīng)(尿素酶、氧化酶、過(guò)氧化氫酶)試驗(yàn)和鏡檢鑒定，確定為H.pylori菌株后保存菌株。

3.抗生素平板配制：藥物敏感度試驗(yàn)的抗生素包括甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素及黃連素?？股貥?biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。在平板上進(jìn)行相應(yīng)抗生素標(biāo)記，每個(gè)平板中添加 2ml 抗生素稀釋液，并用移液管準(zhǔn)確量取 18ml MH 培養(yǎng)基(已加入5%羊血)，混勻后正置待凝固。4℃倒置保存。平板中抗生素終濃度梯度分別為(μg/ml)：①甲硝唑：64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25；②克拉霉素：4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156；③左氧氟沙星：8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312；④阿莫西林：4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156；⑤四環(huán)素：4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156；⑥黃連素：64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125。其中，克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素、甲硝唑的耐藥臨界點(diǎn)分別為 1、2、2、2、8μg/ml, 黃連素的耐藥臨界點(diǎn)目前臨床上還未有明確規(guī)定。

4.藥物敏感度試驗(yàn)：對(duì)保存的菌株統(tǒng)一進(jìn)行藥物敏感度試驗(yàn)。將復(fù)蘇且傳代生長(zhǎng)較好的H.pylori菌株分別收集于0.9%氯化鈉溶液中，配制成吸光度2～3麥?zhǔn)系木鷳乙?，滴加于抗生素平板上，每?2～3μl，每個(gè)平板滴數(shù)在 15～25 滴之間。建立平行 1 組，空白對(duì)照 1 組。于37℃、5%O2、10%CO2的條件下培養(yǎng)2～3 天。判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)H.pylori生長(zhǎng)及受抑制情況記錄每個(gè)梯度生長(zhǎng)的H.pylori菌株。

結(jié) 果

1.患者基本信息：本實(shí)驗(yàn)共分離獲得H.pylori菌株 84 例。入選患者年齡31～55 歲，平均年齡為43.06 歲，男女性別比例為1∶2。男女性別、年齡間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.抗生素對(duì)H.pylori菌株的MIC值：阿莫西林及四環(huán)素對(duì)84例H.pylori菌株的最低抑制濃度(MIC)均小于0.0625μg/ml。其余 4 種抗生素對(duì) 84 例H.pylori菌株的 MIC 范圍為甲硝唑0.5～32μg/ml，克拉霉素0.125～2μg/ml，左氧氟沙星0.0625～4μg/ml，黃連素4～32μg/ml。圖1為各梯度含量下不同MIC值的菌株個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)。由圖1可知，對(duì)于克拉霉素及左氧氟沙星，菌株個(gè)數(shù)在臨界MIC值達(dá)到高峰，在抗生素下一個(gè)梯度含量時(shí)所有菌株都被抑制生長(zhǎng)或殺滅。而甲硝唑及黃連素，隨著MIC值增加，菌株個(gè)數(shù)也增加。甲硝唑在臨界點(diǎn)MIC值前，菌株個(gè)數(shù)不多，達(dá)到臨界點(diǎn)后開(kāi)始呈上升趨勢(shì)。

圖1 不同MIC值的菌株個(gè)數(shù)

3.黃連素與其他抗生素耐藥相關(guān)性：黃連素與甲硝唑耐藥存在顯著相關(guān)性(r=0.403，P=0.008)，由圖1可知，隨著 MIC 值升高，對(duì)甲硝唑及黃連素敏感的菌株個(gè)數(shù)走勢(shì)基本一致。與克拉霉素及左氧氟沙星耐藥無(wú)相關(guān)性(克拉霉素：r=0.181，P=0.251；左氧氟沙星：r=0.248，P=0.113)。

4.H.pylori菌株耐藥率及性別間差異：84 例H.pylori菌株對(duì)阿莫西林及四環(huán)素均敏感，對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑的耐藥率分別為16.67%、16.67%、54.76%?？死顾?左氧氟沙星、左氧氟沙星+甲硝唑、克拉霉素+甲硝唑兩種抗生素耐藥的耐藥率分別為2.38%、9.52%、11.90%?？死顾?左氧氟沙星+甲硝唑 3 種抗生素都耐藥的耐藥率為2.38%。H.pylori菌株對(duì)各抗生素的耐藥率在男、女性別差異如表1所示，本研究結(jié)果顯示，H.pylori菌株對(duì)部分抗生素的耐藥作用與性別無(wú)關(guān)。

表1 各抗生素耐藥率及性別間的差異

5.H.pylori菌株對(duì)黃連素耐藥率分布與性別的關(guān)系：由于黃連素沒(méi)有明確的臨界點(diǎn) MIC 值，本研究將菌株按性別分為兩組，分別將 4、8、16、32μg/ml 設(shè)為耐藥臨界點(diǎn)，對(duì)H.pylori菌株的黃連素耐藥率在男、女性別間進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2，H.pylori菌株對(duì)黃連素的耐藥率在男、女性別間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 H.pylori菌株對(duì)黃連素耐藥率分布與性別的關(guān)系

6.黃連素 MIC 值與不同抗生素耐藥組合的相關(guān)性：本研究對(duì)H.pylori菌株按照全敏感、單種抗生素耐藥、2 種抗生素耐藥和3 種抗生素耐藥分成 4 組，比較黃連素對(duì)這 4 組菌株 MIC 值的平均值，詳見(jiàn)表 2。結(jié)果顯示，隨著菌株對(duì)其他抗生素耐藥性增強(qiáng)，其對(duì)黃連素的耐藥性有增強(qiáng)趨勢(shì)。其中，黃連素對(duì)全敏感菌株的 MIC 和其他3組即對(duì)單耐藥、雙耐藥及 3 種抗生素耐藥菌株的MIC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 黃連素MIC值與不同抗生素耐藥組合的相關(guān)性

討 論

本研究中H.pylori菌株對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑的耐藥率分別為16.67%、16.67%、54.76%?？死顾嘏c左氧氟沙星的耐藥率略低于浙江省平均水平(克拉霉素 16.67% vs 17.9%；左氧氟沙星 16.67% vs 23.13%)，但甲硝唑耐藥率顯著低于浙江省平均耐藥水平(54.76% vs 95.44%,P<0.05)，這可能與溫嶺地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展較快、生活水平普遍較高有關(guān)，人們選擇使用其他非廣譜抗生素代替甲硝唑[10～12]。因此，甲硝唑耐藥水平較低。

研究表明，許多中藥如黃連、大黃、黃芩、板藍(lán)根等對(duì)H.pylori具有抑制和殺滅的作用[13～16]。黃連素作為黃連的主要成分，可以破壞H.pylori菌株莢膜、降低分泌多糖能力，抑制H.pylori形成生物膜，從而達(dá)到抑制和殺滅H.pylori的效果[17]。本研究顯示，黃連素在較低濃度下(4 μg/ml)對(duì)H.pylori菌株就具有抑制或殺滅的作用，與楊行堂等[18]研究結(jié)果一致。同時(shí)，甲硝唑在臨界點(diǎn) MIC 值前，菌株個(gè)數(shù)不多，達(dá)到臨界點(diǎn)后開(kāi)始呈上升趨勢(shì)。甲硝唑在治療給藥過(guò)程中也是呈劑量依賴性的，加大甲硝唑的劑量，能提高H.pylori根除率[19]。黃連素與甲硝唑耐藥呈正相關(guān)，由圖 2 可知，隨著黃連素梯度含量增加，菌株耐藥率越來(lái)越低，即黃連素的抗菌作用越來(lái)越強(qiáng)，與楊行堂等[18]研究結(jié)果也一致。此研究結(jié)果為臨床上運(yùn)用黃連素對(duì)H.pylori進(jìn)行根除治療的用藥方案提供了有利依據(jù)。

本研究判定黃連素 MIC 值范圍為4～32μg/ml。吳靜等[20]用試管 2 倍稀釋法體外測(cè)定黃連素對(duì)H.pylori的 MIC 值為 0.025g/ml。吳明慧等[5]用試管 2 倍稀釋法測(cè)定黃連素對(duì)H.pylori多重耐藥菌株的MIC值為 12.5mg/ml。二者結(jié)果不一致?？赡茉?yàn)椋孩倬瓯旧淼哪退幮跃哂胁町悾狙芯拷Y(jié)果顯示，H.pylori菌株對(duì)黃連素的耐藥性與對(duì)甲硝唑的耐藥性呈正相關(guān)，而本研究菌株對(duì)甲硝唑的耐藥性是顯著低于浙江省耐藥水平的；②菌株的來(lái)源具有較大差異，不同地區(qū)由于地理氣候等條件不同，抗生素使用情況不同，菌株對(duì)抗生素的耐藥性也不同，本研究菌株僅來(lái)源于臺(tái)州溫嶺地區(qū)。

此前有研究表明H.pylori菌株對(duì)部分抗生素的耐藥作用與性別有關(guān)[9, 10]。但本研究顯示H.pylori菌株對(duì)抗生素耐藥作用與性別之間無(wú)相關(guān)性，同時(shí)本研究得出黃連素各梯度含量下對(duì)H.pylori菌株的耐藥率在性別間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這是否跟菌株數(shù)量、菌株來(lái)源及菌株耐藥性等相關(guān)，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

本研究根據(jù)菌株對(duì)不同抗生素的耐藥性將菌株分為4組，分析黃連素對(duì)這4組菌株 MIC 值的平均值，結(jié)果得出隨著菌株對(duì)其他抗生素耐藥性增強(qiáng)，其對(duì)黃連素的耐藥性有增強(qiáng)趨勢(shì)。其中，黃連素對(duì)全敏感菌株的 MIC 和對(duì)單耐藥、雙耐藥及3種抗生素耐藥菌株的MIC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究選取的H.pylori菌株從對(duì)抗生素敏感到耐藥各個(gè)階段均有分布，且所有菌株對(duì)阿莫西林及四環(huán)素都是敏感的，而吳明慧等研究的H.pylori菌株均為多重耐藥菌株，包括對(duì)阿莫西林等抗生素耐藥，因此吳明慧等研究黃連素對(duì)多重耐藥菌株的 MIC 值也相對(duì)較高[5]。這也可以解釋本研究黃連素對(duì)H.pylori菌株 MIC 值范圍為 4～32μg/ml，遠(yuǎn)小于吳明慧等[5]得出的黃連素對(duì)多重耐藥菌株的 MIC 值 12.5mg/ml。

隨著H.pylori對(duì)抗生素耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，H.pylori根除率正逐年下降，研究人員迫切需要尋求新的、更為理想的根治H.pylori方案。本研究結(jié)果表明，黃連素在較低濃度下對(duì)H.pylori具有一定的抑制或殺滅的作用，且隨著黃連素梯度含量增加，抗菌效果增加，可作為治療方案的一種選擇。本研究結(jié)果為中藥參與到H.pylori根除治療打開(kāi)了新思路，為制訂黃連素參與的H.pylori治療方案提供了科學(xué)依據(jù)。