牡蠣中諾如病毒的感染及其防控研究進展

趙 峰，佟利惠，楊 敏，王珊珊，劉 楠，孫 永，周德慶

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所/青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東青島 266071； 2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306； 3. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100）

諾如病毒 (Norovirus, NoV) 是世界范圍內(nèi)引起非細菌性急性胃腸炎的主要病原體，常通過被污染的環(huán)境、水源及水產(chǎn)品如牡蠣等引起急性胃腸炎疫情暴發(fā)[1]。諾如病毒分為7個基因簇 (GI— GVII)，其中GI、GII和GIV可感染人類，是引發(fā)人類疾病的主要類型，以GI、GII最為常見，并可進一步分為9個和22個基因型，而GIV型較少被檢出[1-3]。NoV具有極強的傳染性，僅10個病毒顆粒即可使人致病，被感染者會出現(xiàn)持續(xù)3 d左右的腹瀉或嘔吐，兒童、老年人和有基礎(chǔ)疾病的人群病情可加重[4-5]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全球范圍內(nèi)約1/5的急性胃腸炎暴發(fā)由NoV引起，冬、春季是NoV疫情的高發(fā)期，近年NoV在中國、美國、日本、西歐等均出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)[6-10]。感染者出現(xiàn)感染癥狀的概率隨NoV攝入劑量的增加而增大。海產(chǎn)貝類因其底棲和濾食性特性，可從海洋環(huán)境中富集NoV。素有“海洋牛奶”之稱的牡蠣是我國沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟貝類，也是NoV的重要傳播媒介之一。雖然徹底加熱處理可有效滅活牡蠣中的NoV，但為了保持其鮮美風(fēng)味，人們傾向于生食或輕微烹煮，若食用的牡蠣存在NoV污染，便會增加感染NoV的風(fēng)險。

對食品中NoV的檢測主要采用反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng) (Reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)，但此方法不能區(qū)分NoV是否具有活性或感染性。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)豬胃黏蛋白偶聯(lián)磁珠 (Porcine gastric mucin-conjugated magnetic beads, PGM-MB)、核酸嵌入劑 [疊氮溴化丙錠 (Propidium monoazide, PMA) 和疊氮溴化乙錠 (Ethidium monoazide,EMA] 等結(jié)合RT-qPCR方法檢測感染性NoV有效果[11-15]。超高壓 (High hydrostatic pressure, HHP) 處理作為一種非熱加工技術(shù)，主要用于生產(chǎn)高端生食產(chǎn)品，應(yīng)用于牡蠣不僅可殺滅有害病原體、延長貯藏期，還可用于脫殼。本文綜述了牡蠣中NoV的污染狀況、富集機制、檢測方法以及HHP處理技術(shù)對NoV消減控制方面的研究進展，旨在為牡蠣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與食用安全提供參考。

1 牡蠣中 NoV 的污染與富集機制

1.1 NoV對牡蠣的污染狀況

許多由NoV引起的食源性急性胃腸炎暴發(fā)均與食用牡蠣有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，與牡蠣相關(guān)的食源性疾病中，約一半由NoV引起[16]。牡蠣是濾食性雙殼類，每小時可過濾約20 L海水，在過濾海水時環(huán)境中的NoV可進入牡蠣體內(nèi)并富集[17]，牡蠣體內(nèi)的病毒濃度比周圍環(huán)境高幾十甚至幾千倍[3,18-19]。且牡蠣的棲息地主要在沿海河口，營固著生活，NoV可以通過多種方式進入牡蠣生產(chǎn)區(qū)，如城市排污管、污水處理廠未處理徹底的污水、進入生產(chǎn)區(qū)的感染NoV的人等[20]。生長水域被NoV污染后，牡蠣會通過自身的濾食作用從污染的水中富集NoV，并在消化道等部位積累；NoV一旦進入體內(nèi)，牡蠣很難通過自身代謝或凈化作用將其排出體外[21]。

每年11月至翌年3月是牡蠣消費旺季，也是因食用受NoV污染的牡蠣而染病的高風(fēng)險季節(jié)?？軙韵嫉萚22]應(yīng)用RT-qPCR方法對廣東省地區(qū)市售牡蠣中NoV的污染狀況進行調(diào)查與分型鑒定，發(fā)現(xiàn)牡蠣樣品的NoV總檢出率為17.20% (50/290)，不同季節(jié)的NoV污染率分別為春季12.50%、夏季6.90%、秋季18.30%和冬季30.70%，冬季顯著高于其他季節(jié)，NoV的基因型以GII型 (11%) 為主。呂素玲等[23]對廣西養(yǎng)殖牡蠣中NoV的污染狀況進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牡蠣樣品中NoV總檢出率為11.04% (53/480)，其基因型為GII型。馬麗萍[24]對黃渤海區(qū)沿海城市牡蠣中NoV污染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，NoV檢出率可達19.35%。Liu等[16]對山東省沿海地區(qū)牡蠣養(yǎng)殖區(qū)進行了為期1年的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)NoV檢出率為16.9% (60/356)；60份陽性樣本中，43.3%(26/60) 為 GI型，31.7% (19/60) 為 GII型，25.0% (15/60) 同時檢出GI和GII；陽性樣本大多為冬季樣本，占65.0%(39/60)。上述研究表明，我國牡蠣中NoV的污染水平相對較高，冬季NoV的污染水平顯著高于其他季節(jié)，應(yīng)加強防控。

1.2 牡蠣與NoV結(jié)合機制

組織血型抗原 (Histo-blood group antigens, HBGAs) 為人類結(jié)合NoV的受體，是一類具有高度多態(tài)性的糖類抗原，在腸道上皮細胞上表現(xiàn)為ABO型、分泌型和Lewis型。研究表明，牡蠣體內(nèi)也存在類似的HBGAs，被認為是NoV同牡蠣相結(jié)合的受體，NoV通過與牡蠣組織中的類HBGAs特異結(jié)合，使得NoV難以排出體外[25]。Le Guyader等[26-27]對太平洋牡蠣 (Crassostrea gigas) 組織中的類 HBGAs 與 NoV 病毒樣顆粒 (Virus-like particles, VLPs)特異結(jié)合的研究表明，GI.1型VLPs只與太平洋牡蠣的消化腺結(jié)合，而GII.3、GII.4型VLPs可與太平洋牡蠣的所有組織結(jié)合。此外，環(huán)境因素如溶解氧、pH、溫度和鹽度均會對牡蠣類HBGAs的表達產(chǎn)生影響，高溶氧量、高pH、低溫和高鹽利于牡蠣中類A型HBGAs的表達[28-29]，在此條件下NoV更易在牡蠣體內(nèi)積累[30]。但牡蠣中類HBGAs的產(chǎn)生以及調(diào)控NoV積累的機制還有待進一步研究。

2 牡蠣中 NoV 的檢測方法

2.1 NoV定量檢測方法

2013年國際標準化組織發(fā)布定性和定量檢測各種食品(包括貝類) 中 NoV 的標準方法 (ISO/TS 15216-1和 ISO/TS 15216-2)，中國于2016年也頒布了貝類中NoV的RT-qPCR檢測方法標準。RT-qPCR具有靈敏度高、可定量檢測等優(yōu)點，在進行RT-qPCR前先要提取病毒RNA，由于NoVs在牡蠣中的含量較低且回收富集困難，因此尋找簡便有效的牡蠣中NoVs RNA的提取方法對后續(xù)的檢測尤為重要[31-32]。Zhang 等[32]以現(xiàn)行 ISO/TS 15216-2: 2013為基礎(chǔ)，對4種從牡蠣消化組織中提取NoV的方法進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白酶K消化聯(lián)合聚乙二醇沉淀法效果最好，該方法的回收率和擴增效率分別為 (11.07±0.09)%和 (124.12±5.99)%，是 ISO/TS 15216-2: 2013方法的 7倍。

牡蠣中含有的NoV顆粒較少，研究已證實少數(shù) (僅10個) 具有感染活性的NoV顆粒即可引發(fā)人類急性胃腸炎，且在食品基質(zhì)及環(huán)境中NoV基因組的穩(wěn)定性也遠高于其他具有相應(yīng)感染活性的病毒[17]。目前，現(xiàn)有的有關(guān)NoV檢測的國家、國際檢測標準大多以RT-qPCR擴增結(jié)果為依據(jù)，但這種檢測方法并不能辨別NoV的感染性 (RT-qPCR會同時擴增NoV中游離、部分降解或受損的以及受損衣殼中的RNA)，導(dǎo)致感染性NoV的檢出率偏高，因此感染性NoV的確證一直是檢測技術(shù)的瓶頸。

NoV最早在電子顯微鏡下被觀察到，電鏡法可對糞便樣本中的NoV顆粒進行觀察檢測。酶聯(lián)免疫吸附 (Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 也是一種檢測 NoV 的方法，但其靈敏度不高，檢測限為每克104～106且耗時較長，特別是在檢測牡蠣中低含量水平的NoV時容易受到限制。

宏基因組測序可以檢測和識別病毒基因組物質(zhì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食源性病毒的檢測。Imamura等[33]對日本6個不同地點的牡蠣中感染性NoV進行了為期5個月的檢測，通過測序?qū)蛐瓦M行了鑒定。Strubbia等[34]通過宏基因組學(xué)方法評估3種牡蠣類型中NoV的積累規(guī)律時發(fā)現(xiàn)宏基因組學(xué)方法在檢測牡蠣樣本中低濃度NoV時較為困難。由于NoV的基因型具有多樣性，在牡蠣中的含量也較低，導(dǎo)致病毒宏基因組學(xué)在檢測中的應(yīng)用仍存在挑戰(zhàn)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于NoV檢測的方法是RT-qPCR[35]。

2.2 感染性NoV的檢測方法

2.2.1 與 HBGAs 結(jié)合的檢測方法 具感染性的 NoV 衣殼蛋白是完整的，可與HBGAs結(jié)合，故能通過檢測衣殼與HBGAs的結(jié)合能力來評估NoV是否具有感染性。豬胃黏蛋白 (Porcine gastric mucin, PGM) 含有 A、H1和 Lewis b型HBGAs，NoV與PGM的相互作用可以抑制NoV與HBGAs的結(jié)合能力[36]。利用PGM與磁珠結(jié)合捕獲NoV，再進行 RT-qPCR檢測NoV，可有效檢測牡蠣中的感染性NoV。已有大量報道應(yīng)用PGM-RT-qPCR測定NoV在各種消減處理后的滅活情況，如熱處理、含氯消毒劑等[37]。Leon等[38]對人工污染NoV的牡蠣樣品進行HHP處理滅活NoV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)400 MPa HHP處理后，NoV成活率降低至21%，在600 MPa下處理后能對NoV 完全滅活。Ye等[39]為了驗證PGM-RT-qPCR檢測方法的可行性，采用與Leon等[38]完全相同的實驗條件處理牡蠣，并利用PGM-RT-qPCR進行測定，結(jié)果表明此方法對感染性NoV的檢出率與Leon等[38]的結(jié)論有密切的相關(guān)性。使用PGM研究不同HHP處理條件對NoV滅活效果的大量實驗證明，PGMRT-qPCR是一種可有效區(qū)分感染性NoV的檢測方法。

2.2.2 與核酸嵌入劑結(jié)合的檢測方法 核酸嵌入劑如EMA和PMA已被許多研究者作為區(qū)分感染性與非感染性NoV的方法[13-14]。PMA是一種高親和力的光反應(yīng)性核酸染料，不能進入衣殼蛋白完整的病毒，但能夠穿透被破壞或損壞的衣殼，穿透后在強光照射下共價插入RNA，干擾RT-qPCR擴增[12]。Randazzo等[14]對不同核酸嵌入劑進行對比，結(jié)果表明PMAxx對感染性NoV的區(qū)分效果優(yōu)于EMA，PMAxx處理后感染性NoV的減少量高于EMA 0.64 lg。PMA可與RT-qPCR檢測方法結(jié)合，在RT-qPCR檢測前對樣品進行預(yù)處理，以區(qū)分感染性病毒。Kim和Ko[12]用PMAxx-RT-qPCR方法檢測鑒別時發(fā)現(xiàn)PMAxx-RT-qPCR可以有效區(qū)分感染性NoV。PMAxx已在區(qū)分感染性NoVs方面應(yīng)用廣泛，未來的研究中可對PMAxx濃度、照射時間等處理條件進一步優(yōu)化。

PGM-RT-qPCR與PMA-RT-qPCR已應(yīng)用于HHP處理對NoV消減滅活效果評價的研究，研究顯示經(jīng)PGM或PMA處理后，500 MPa HHP對NoV滅活的減少量要比僅用qPCR多，GI.1型NoV減少3 lg，GII.4型可減少4 lg[40-41]。由于PMA與NoV核酸結(jié)合的效率取決于濃度、光活化及孵育時間等諸多因素，這些因素均會對PMA與NoV的結(jié)合效率產(chǎn)生影響。而PGM可以與NoV特異性結(jié)合，所以PGM在檢測感染性NoV靈敏度方面優(yōu)于PMA。PGM的成本與PMA相近，綜合而言，PGM與免疫磁珠、qPCR結(jié)合在區(qū)分感染性NoV中具有較大的推廣潛力。

3 牡蠣中 NoV 的防控措施

3.1 熱加工方法

熱處理是滅活牡蠣中NoV的有效方法之一，中國疾病預(yù)防控制中心指南顯示，餐具表面NoV的消除需煮沸消毒30 min。將帶殼牡蠣蒸煮3 min，消化道內(nèi)部溫度僅有63 ℃，不足以滅活NoV。將受NoV污染的牡蠣消化腺內(nèi)部溫度保持在90 ℃持續(xù)90 s，即可實現(xiàn)病毒滅活[42]。但過度加熱會對牡蠣的風(fēng)味和外觀產(chǎn)生負面影響。

3.2 牡蠣收獲后凈化處理消減NoV

牡蠣在收獲后，通常會在凈化池中暫養(yǎng)2～3 d，使其通過自身作用排出有毒有害物質(zhì)。此處理對牡蠣中細菌的消減效果較好，但對NoV的消減效果不顯著[43]。由表1可知，凈化對NoV消減效果不明顯，延長凈化時間可以在一定程度上消減NoV，但其效果仍難以達到NoV安全劑量水平。因此，為了保持牡蠣的新鮮美味且兼顧安全性，還需依賴HHP等非熱現(xiàn)代食品加工技術(shù)的發(fā)展。

表1 凈化對牡蠣中諾如病毒消除效果的影響Table 1 Effect of purification on elimination of NoV in oysters

3.3 HHP處理對牡蠣中NoV的消減控制效果

HHP、輻照、酸性電解水等方法常用于殺滅貝類中的有害病原體，這些非熱處理方法能較好地保持牡蠣原有的營養(yǎng)、口感、風(fēng)味、色澤以及新鮮度。在輻照過程中，射線穿透牡蠣，可直接或間接破壞NoV的核酸以及衣殼蛋白，從而殺死NoV。低劑量 (<10 kGy) 的輻射不會改變產(chǎn)品原有的感觀性狀，保證了其營養(yǎng)價值且無任何有害物質(zhì)殘留。酸性電解水的主要功能成分是次氯酸，次氯酸分子量小，可以擴散到細胞體內(nèi)，使病毒衣殼蛋白氧化，從而滅活NoV[47]。輻照和電解水技術(shù)在牡蠣加工中雖有應(yīng)用，但并不廣泛。目前，牡蠣加工中應(yīng)用最廣泛的是HHP技術(shù)，可在消減牡蠣中有害病原體的同時實現(xiàn)脫殼。

3.3.1 HHP滅活 NoV 的原理及牡蠣品質(zhì)的變化 HHP是食品工業(yè)廣泛應(yīng)用的一種控制食源性病原體的非熱加工處理方法[48-49]。目前，HHP技術(shù)在牡蠣等雙殼類的加工中主要用于脫殼，且剝離的貝肉完整，可以節(jié)省勞動力[50]。通常用于牡蠣等貝類加工的壓力范圍為200～600 MPa，應(yīng)用HHP技術(shù)處理牡蠣時，壓力迫使牡蠣組織中的水進入病毒，導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級和四級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使病毒衣殼蛋白變性，從而致使病毒生物活性和繁殖能力喪失，無法與宿主細胞表面受體結(jié)合[51-52]。使用HHP處理時，壓力在整個牡蠣中傳遞均勻、瞬時，且過程中溫度變化很小 (約為3 ℃每100 MPa)，可以減少食品的形變和感官特性的改變[53]。

與熱加工處理方法相比，HHP技術(shù)可以降低對食品造成的質(zhì)量損失，保留大部分天然的色、味，維生素和揮發(fā)性化合物等對熱敏感的營養(yǎng)物質(zhì)可保持不變[54]，且對產(chǎn)品的形狀、大小沒有要求[55]。研究表明HHP處理可能會對牡蠣的外觀、顏色、氣味和質(zhì)地產(chǎn)生影響。目前，在牡蠣加工生產(chǎn)中，一般認為壓力超過300 MPa會影響其理化品質(zhì)，使其顏色變黃，這是由于HHP可以加劇脂肪的氧化，且氧化程度與壓力處理水平呈正相關(guān)[56]。但總體來說利大于弊，原因為：1) 使用HHP對牡蠣進行開殼后，肉比較完整，這點要優(yōu)于傳統(tǒng)的人工開殼方式，手工開殼時牡蠣肉可能會被刀片切碎。2) HHP處理后，牡蠣肉的硬度和耐咀性略有增強。硬度是評價牡蠣新鮮度的一個重要指標，HHP處理后的牡蠣肉硬度輕微增強，優(yōu)于未處理牡蠣。3) 在壓力的作用下，牡蠣殼內(nèi)的水被擠壓到組織內(nèi)部，使其多汁性和風(fēng)味得到很好的保持[57]。

3.3.2 影響 HHP 滅活效果的因素 HHP 處理 NoV 時，有許多需要考慮的因素，雖然對消減效果具決定性作用的是施加的壓力水平，但加壓時間、加壓初始溫度及NoV所在基質(zhì)等也會對消減效果產(chǎn)生相當大的影響。研究表明，延長加壓時間確實會使NoV減少量增多，但隨著時間的延長，病毒減少量差異變小[58]。牡蠣含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，這些物質(zhì)會在HHP處理過程中對NoV形成保護作用，降低HHP對NoV的消減效果；低pH也會抑制HHP對NoV的消減效果[59]。有研究認為溫度對消減效果的影響較大，降低加壓溫度，如4 ℃或6 ℃下與20 ℃相比，前者NoV的減少量顯著提高[39, 41]。

3.3.3 HHP 對 NoV 消減效果的研究 由于 HHP處理對貝類的感官特征和營養(yǎng)品質(zhì)的影響很小，國內(nèi)外研究者對應(yīng)用HHP來消減牡蠣等貝類中的NoV產(chǎn)生了濃厚的興趣。HHP對NoV研究的試驗表明，需要400 MPa以及更高壓力才能使牡蠣中的NoV大量滅活[41,60-62]。HHP對牡蠣中NoV消減效果的影響見表2。Leon等[38]對人類志愿者進行了雙盲臨床試驗，以評估HHP滅活GI.1 NoV所需條件，將4 lg 基因拷貝數(shù)的GI.1 NoV注入牡蠣，結(jié)果顯示只有600 MPa、6 ℃下NoV才完全滅活，受試者完全未出現(xiàn)感染情況。400 MPa、6 ℃處理下，受試者患病概率降低，可以推測此處理條件可以滅活大多數(shù)NoV。Ye等[39]于0 ℃、350和500 MPa下對牡蠣中的GI.1和GII.4 NoV進行處理，NoV基因拷貝數(shù)可減少4 lg。Takahashi等[62]對緩沖液、牡蠣勻漿、帶殼牡蠣3種基質(zhì)中的NoV進行HHP處理，結(jié)果表明HHP對這3種基質(zhì)中的NoV均有消減效果，但在緩沖液、牡蠣勻漿、帶殼牡蠣中的消減效果依次降低，表明HHP對NoV的消減效果與病毒所處的環(huán)境基質(zhì)有關(guān)，牡蠣中的脂肪和蛋白質(zhì)可以保護NoV不受HHP影響。此外，HHP處理過程中時間、pH、鹽度等對病毒的滅活效果也有一定影響，在中性pH條件下，GI.1和GII.4 NoV 的減少量 (2.3 lg 和>3.8 lg) 高于 pH=4 (0.4 lg 和1.2 lg)[21]。

表2 超高壓對牡蠣中諾如病毒消減效果的影響Table 2 Effects of high hydrostatic pressure on inactivation effect of NoV in oysters

此外，Kim等[63]將紫外線照射與HHP處理結(jié)合來滅活NoV的實驗表明兩者對病毒具有協(xié)同滅活作用。在實際生產(chǎn)中的成功應(yīng)用證明，與單獨的HHP處理相比，紫外照射輔助組合可實現(xiàn)更好的病毒滅活效果。

3.3.4 HHP在牡蠣產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中的挑戰(zhàn) HHP技術(shù)可以有效消減牡蠣體內(nèi)的NoV，但它在牡蠣加工中的廣泛應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，最主要的挑戰(zhàn)是設(shè)備成本較高，對小規(guī)模經(jīng)營的牡蠣養(yǎng)殖場來說經(jīng)濟負擔太大。其次，多個牡蠣養(yǎng)殖場聯(lián)合共用一臺HHP處理裝置可降低成本，但也存在一些問題：若牡蠣養(yǎng)殖區(qū)分布廣，會導(dǎo)致無法在短時間內(nèi)及時加工牡蠣，這也是高品質(zhì)牡蠣生產(chǎn)加工中所面臨的問題；在牡蠣生產(chǎn)旺季時，又會因生產(chǎn)消費高峰而導(dǎo)致設(shè)備供不應(yīng)求。最后，HHP技術(shù)生產(chǎn)的牡蠣產(chǎn)品，考慮其運作成本，將以高端牡蠣產(chǎn)品為主，且適合短期消費，現(xiàn)今在大眾接受普及度方面相對較低。目前有關(guān)HHP對牡蠣中NoV消減效果的研究多以人工污染牡蠣勻漿為主，在評估消減效果方面的準確性不足，同時加壓和卸壓過程中可能發(fā)生變化和內(nèi)在反應(yīng)，這些還需更深入的研究。

4 展望

食源性NoV引發(fā)的公共安全事件越來越引起公眾的關(guān)注。中國是世界上最大的牡蠣生產(chǎn)國，牡蠣是NoV傳播的重要載體，其食用安全至關(guān)重要。研究牡蠣同NoV的結(jié)合特點與機制，建立可區(qū)分NoV感染性的檢測方法，評價不同加工方式對NoV的消減效果，是提高牡蠣食用安全性的重要手段。在保持牡蠣的感官品質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)的前提下，應(yīng)用HHP處理等非熱加工技術(shù)建立有效消減牡蠣中NoV的方法，開發(fā)新的牡蠣加工產(chǎn)品，是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要。