基于響應曲面法優(yōu)化桑黃黃酮發(fā)酵條件

謝春芹 曹正 王春野

摘要：桑黃是一種珍貴的藥用真菌，通過響應面分析法對桑黃的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，進而提高該菌株黃酮類活性物質(zhì)的產(chǎn)量。利用不同碳源、不同氮源對桑黃進行液體發(fā)酵，測定胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量，篩選出最佳種類的碳源和氮源。進一步通過單因素試驗考察不同濃度碳、氮源及培養(yǎng)基初始pH值對胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量的影響。利用響應面分析法對桑黃黃酮發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，獲得黃酮產(chǎn)量最高的培養(yǎng)基組合。結(jié)果表明，桑黃產(chǎn)黃酮的最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是酵母提取物。優(yōu)化后黃酮發(fā)酵培養(yǎng)基中的麥芽糖濃度為46.5 g/L，酵母提取物濃度為6.0 g/L，培養(yǎng)基初始pH值為 4.32，優(yōu)化后培養(yǎng)基黃酮產(chǎn)量達到（65.3±2.5） mg/L。獲得了桑黃黃酮發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，為進一步研究桑黃黃酮生物合成調(diào)控以及提高桑黃黃酮含量奠定了基礎。

關(guān)鍵詞：桑黃;黃酮;響應面分析法;發(fā)酵培養(yǎng)基

中圖分類號： S188+.4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0222-04

桑黃（Phellinus linteus）是一種極名貴的藥用真菌，在我國和韓國有著悠久的應用歷史[1-2]。近年來，國內(nèi)外對桑黃的活性成分進行了深入研究，其主要活性成分包括黃酮類、多糖類化合物等[3-4]。這些活性成分具有抗氧化、抗病毒、抑制胃癌細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫等多種活性[5-7]。雖然桑黃活性成分具有多種藥理學活性，但其活性成分含量較低;因此，改良桑黃藥用品質(zhì)，提高其活性成分含量，成為當前桑黃研究的主要目標[8]。目前，作為桑黃主要藥用成分的黃酮類化合物引起了較多關(guān)注。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，萘乙酸（naphthaleneacetic acid）和香豆素（coumarin）能促進桑黃黃酮類化合物的生物合成[9]。Lung等研究不同提取工藝對桑黃活性提取物抗氧化能力及黃酮含量的影響[10]。然而，現(xiàn)階段使用的培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的桑黃中的黃酮類化合物含量較低。為了提高桑黃中黃酮類化合物的含量，本研究對桑黃基礎發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，為深入研究桑黃黃酮類化合物生物合成調(diào)控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)條件

桑黃菌株由筆者所在實驗室保存于PDA培養(yǎng)基斜面上。在PDB培養(yǎng)基中進行桑黃菌絲體接種，在搖床上于 150 r/min、25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d作為液體母種。基礎發(fā)酵培養(yǎng)基組分：葡萄糖20.0 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨 1.0 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始pH值5.5。接種量5%，于25 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。

1.2 黃酮測定方法

精確稱取0.05 g菌絲粉末，加入5 mL 70%乙醇，放入超聲清洗機中超聲1 h獲得萃取液。取1 mL提取液，用 NaNO2-Al（NO3）3比色法測定黃酮含量。以蕓香苷標準品制作標準曲線，計算桑黃中的黃酮含量。提前0.5 h打開分光光度計調(diào)至510 nm預熱，以未添加蕓香苷標準液的標準曲線管為調(diào)零管進行調(diào)零，測定各管吸光度，繪制標準曲線，計算各管中黃酮含量[9]。

1.3 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

1.3.1 針對碳源優(yōu)化培養(yǎng)基 選取葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和玉米粉各20 g分別作為碳源替換基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變，接種量為5%，25 ℃恒溫培養(yǎng)14 d后測定黃酮含量以確定最佳碳源。在此基礎上，通過改變培養(yǎng)基中最佳碳源濃度再次發(fā)酵，確定最佳碳源的適合濃度。

1.3.2 針對氮源優(yōu)化培養(yǎng)基 選取酵母提取物、蛋白胨、天冬酰胺、尿素和硫酸銨各2 g分別作為氮源替換基礎培養(yǎng)基中的酵母提取物和蛋白胨，其他成分不變，發(fā)酵后測定黃酮含量以確定最佳氮源。在此基礎上，通過改變培養(yǎng)基中最佳氮源的濃度再次發(fā)酵，確定最佳碳源的最適濃度。

1.3.3 針對不同初始pH值優(yōu)化培養(yǎng)基 將基礎培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)節(jié)為3.5、4.5、5.5、6.5和7.5，其他條件不變，發(fā)酵后測定黃酮含量以確定最佳初始pH值。

1.4 響應面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基

基于單因素篩選的碳源、氮源以及初始pH值的試驗結(jié)果，利用Design-Expert軟件，以Central Composite Design 3因子設計試驗方案（表1），進行發(fā)酵后以桑黃黃酮類化合物含量作為優(yōu)化指標，進行條件優(yōu)化。獲得最佳培養(yǎng)基條件后，按最佳條件進行發(fā)酵試驗驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量的影響

由圖1-A可見葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和玉米粉等不同碳源對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量的影響。發(fā)現(xiàn)以麥芽糖作為碳源，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量最高，達到51.64 mg/L，是葡萄糖組的136.7%。除此之外，其他碳源發(fā)酵組黃酮產(chǎn)量都小于葡萄糖組。在此基礎上，筆者選擇麥芽糖作為最佳碳源，通過不同濃度麥芽糖進行發(fā)酵，測定桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量，詳見圖1-B，可見不同濃度麥芽糖對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量影響較大。20 g/L的麥芽糖處理下桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量最大，達65.87 mg/L。

2.2 氮源對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量的影響

不同氮源對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量的影響見圖2-A。以酵母提取物作為氮源時，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量最高，達 56.45 mg/L。以硝酸銨作為氮源時，桑黃生長較差，黃酮類化合物產(chǎn)量最低，僅為5.22 mg/L。在此基礎上，筆者選擇酵母提取物作為最佳氮源，通過不同濃度蛋白胨進行發(fā)酵，測定桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量，由圖2-B可知，不同濃度酵母提取物對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量影響較大。4 g/L酵母提取物處理下，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量最大，達57.45 mg/L。而酵母提取物濃度大于6 g/L時，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量顯著下降。

2.3 初始pH值對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量的影響

不同初始pH值對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量的影響，由圖3可知，初始pH值=5時，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量達63.46 mg/L。初始pH值升高至8時，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量下降到 14.61 mg/L。結(jié)果表明，培養(yǎng)基不同初始pH值對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量影響較大。

2.4 響應面分析法優(yōu)化桑黃黃酮類化合物發(fā)酵培養(yǎng)基

在上述單因素試驗的基礎上，筆者采用響應面分析法對液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。根據(jù)試驗優(yōu)化方案，安排27個試驗組，對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量進行測定，見表1。由結(jié)果可知，以桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量為響應值進行曲面擬合（圖4）并獲得回歸方程：

Y=56.41+9.12×X1-0.77×X2-8.79×X3-2.14×X1×X2-3.80×X1×X3+2.23×X2×X3-7.12×X12-7.48×X22-7.94×X32。

式中：Y為桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量，X1為麥芽糖濃度，X2為酵母提取物濃度，X3為初始pH值。

基于試驗響應值的典型分析結(jié)果，該模型擬合度的R2值為0.849 1，擬合度較好。根據(jù)模型預測得出，當麥芽糖濃度為46.5 g/L，酵母提取物濃度為6.0 g/L，初始pH值為4.32時，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量獲得最大值，達64.07 mg/L。對響應曲面預測值進行驗證試驗，應用優(yōu)化培養(yǎng)基，測得黃酮產(chǎn)量為 （65.3±2.5） mg/L。預測值與驗證試驗所得桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量較為接近，表明回歸方程能夠比較真實地反映各因素對桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量的影響。

3 討論

大型擔子真菌的次生代謝產(chǎn)物很多都是具有生物活性的天然產(chǎn)物，相關(guān)研究是真菌研究的熱點問題之一[11]。真菌次生代謝通常會受到真菌生長環(huán)境或營養(yǎng)條件的影響[12]。Tian等通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分提高了桑黃中黃酮類化合物的含量[13]。Zhao等通過改變培養(yǎng)基中氮源含量促進了靈芝酸的生物合成[14]。Wu等報道了pH值信號調(diào)控次生代謝基因的表達[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，無論是碳源、氮源還是初始pH值都會影響桑黃黃酮類化合物的生物合成，并且次生代謝產(chǎn)物含量變化幅度較大。通過響應面分析法對培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化時，筆者發(fā)現(xiàn)碳源、氮源和初始pH值在影響桑黃黃酮類化合物生物合成時還存在兩兩相互作用。這些結(jié)果均提示，桑黃黃酮類化合物生物合成響應環(huán)境因子調(diào)控的機制較復雜。因此，下一步筆者將在現(xiàn)有優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，進一步通過單一因素研究其調(diào)控機制。

桑黃是一種傳統(tǒng)藥用真菌[16-17]。隨著現(xiàn)代藥理學研究的深入，桑黃的許多新的生物學活性被報道。研究者對桑黃活性成分的生物合成調(diào)控的研究也隨之開展。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，萘乙酸（NAA）促進桑黃黃酮的生物合成[9]。Tian等針對桑黃的雙階段發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)（黃酮、多酚和多糖）進行了條件優(yōu)化[13]。此外，Guo等針對植物激素吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）和NAA對桑黃的發(fā)酵生物量以及胞外多糖含量的影響進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5.0 mg/L NAA對桑黃的生物量和胞外多糖含量有顯著的誘導作用[8]。本研究首次對桑黃黃酮類化合物發(fā)酵培養(yǎng)基進行了全面優(yōu)化，桑黃黃酮類化合物產(chǎn)量顯著提高，為今后深入研究桑黃黃酮類化合物的生物合成機制，進一步提高桑黃黃酮類化合物的生物合成效率提供了基礎保障。

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