二甲雙胍增強(qiáng)人結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性

張璐，劉浩，李佳會(huì)，王清清，張配

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院∥安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠 233030)

結(jié)腸直腸癌，也稱為結(jié)腸癌，是全球癌癥死亡的主要原因之一，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的前3位.針對早期結(jié)腸癌，目前臨床多采取內(nèi)鏡微創(chuàng)治療[1]，中晚期癌以手術(shù)切除及隨后的化療、放療等傳統(tǒng)療法為主，但效果多不理想.尤其是單一藥物治療，存在不良反應(yīng)且易產(chǎn)生耐藥.20世紀(jì)50年代以來，5-氟尿嘧啶(5-FU)一直作為結(jié)腸癌治療的基本化療藥物廣泛應(yīng)用于臨床，但由于結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥導(dǎo)致的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]，以及對正常細(xì)胞毒副作用所致的低耐受性限制了其臨床應(yīng)用[3].因此，尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物和新的治療靶點(diǎn)是臨床亟待解決的問題.二甲雙胍作為治療2型糖尿病的藥物50多年來被廣泛使用，并被證明具有潛在的抗腫瘤活性，是一種耐受性良好的藥物.此外，二甲雙胍與部分化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以增強(qiáng)化療藥物的敏感性，減少化療藥物的用藥劑量，甚至可以逆轉(zhuǎn)某些耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性[4].關(guān)于二甲雙胍是否可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對5-FU的敏感性仍少有報(bào)道，且其分子機(jī)制尚不詳盡.本課題研究了二甲雙胍聯(lián)合5-FU對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響，初步探討二甲雙胍增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU敏感性的機(jī)制，以期為結(jié)腸癌新的治療途徑提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞庫.

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基，購自美國HyClone公司.胎牛血清，購自杭州四季青公司.二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、鹽酸二甲雙胍, 購自美國Sigma公司.氟尿嘧啶注射液，購自上海旭東海普藥液有限公司.胰酶細(xì)胞消化液、蛋白裂解液、磷脂結(jié)合蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)、線粒體膜電位試劑盒(JC-1)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司.兔抗人Mcl-1、Bcl-2、Bak、Bax、β-actin抗體，購自美國Proteintech公司.山羊抗兔IgG，購自美國Abbkine公司.Immobilion Western HRP底物顯色試劑，購自美國Millipore公司.

1.1.3 儀器

CO2飽和濕度培養(yǎng)箱 3111型，購自美國賽默飛世爾科技公司.正置熒光顯微鏡DM2500型，德國Leica公司.多功能酶標(biāo)儀Synerge II型，購自美國BioTex公司.DxP AthenaTM流式細(xì)胞儀，購自美國Cytek公司.活細(xì)胞工作站Obsever Z1型，購自德國ZEISS公司.蛋白電泳儀Mini-Protena型，購自美國Bio-Rad公司.化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)Fluor Chem HD2型，購自美國Alpha Innotech公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

LoVo細(xì)胞采用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(以下簡稱培養(yǎng)液)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每24 h對細(xì)胞做常規(guī)性檢查，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，2～3 d換一次培養(yǎng)液，根據(jù)其生長狀態(tài)做傳代處理，并取對數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

將含有6×103個(gè)LoVo細(xì)胞的100 μL單細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，分別加入培養(yǎng)液配制的不同終濃度的二甲雙胍溶液(0、1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)和不同質(zhì)量濃度的5-FU溶液(0、12.5、25、50、100、200 μg/mL)或兩者混合溶液，同時(shí)設(shè)陰性對照組(只含LoVo細(xì)胞和培養(yǎng)液)和空白對照組(只含培養(yǎng)液)，每個(gè)濃度及質(zhì)量濃度均設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h；然后每孔加15 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后,棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，酶標(biāo)儀振板20 s，檢測490 nm波長下每孔的光密度，并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=

1.2.3 聯(lián)合指數(shù)分析藥物協(xié)同效應(yīng)

用MTT法測得單藥不同藥物劑量的抑制率后，可以得到細(xì)胞的劑量—效應(yīng)曲線，通過CompuSyn分析軟件計(jì)算其聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI).聯(lián)合指數(shù)的公式為CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，其中(D)1、(D)2分別為聯(lián)合用藥時(shí)兩藥各自的濃度或質(zhì)量濃度，Dx為聯(lián)合用藥達(dá)到fa時(shí)，單藥抑制率也達(dá)到fa時(shí)所需要的藥物濃度，Dx=Dm[fa/(1-fa)]-m，fa表示一定濃度及質(zhì)量濃度的兩藥聯(lián)合用藥達(dá)到的抑制率.通過軟件輸入單藥的劑量及抑制率可得到Dm值和m值，再經(jīng)上述聯(lián)合指數(shù)計(jì)算公式就可得到某種聯(lián)合用藥方案的效應(yīng)，CI值小于1表示此方案具有協(xié)同效應(yīng).

1.2.4 集落克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

將含有5×103個(gè)LoVo細(xì)胞的2 mL單細(xì)胞懸液接種于6孔板.根據(jù)MTT結(jié)果選擇使用明顯低于IC50值的濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍和質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL的5-FU 以及兩者混合溶液進(jìn)行此實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍組、質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL的5-FU組和聯(lián)合用藥組(濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍和質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL的5-FU).24 h后棄去原培養(yǎng)液，加藥后37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察克隆大小，5 d后(大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50)終止培養(yǎng).棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌2次，每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛于-20 ℃固定10 min；棄固定液，PBS洗滌1次，加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的結(jié)晶紫染色液室溫染色10 min,去離子水緩慢洗滌數(shù)次，室溫干燥，數(shù)碼照相機(jī)拍攝，計(jì)數(shù)克隆數(shù)量并計(jì)算克隆形成率.

1.2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按1×105/孔接種于6孔板.根據(jù)MTT結(jié)果選擇使用接近且不高于IC50值的聯(lián)合用藥組濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍組、質(zhì)量濃度為50 μg/mL的5-FU組和聯(lián)合用藥組(濃度為1.25 mmol/L二甲雙胍和質(zhì)量濃度為50 μg/mL的5-FU).24 h后棄去原培養(yǎng)液，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用不含EDTA的胰酶消化、收集細(xì)胞至10 mL離心管，1 000 r/min，離心5～10 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞；加入400 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，置冰浴，各組加入1 μL Annexin V-FITC和1 μL PI于細(xì)胞懸液中，室溫、避光染色5～15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，觀察凋亡細(xì)胞百分比.

1.2.6 JC-1染色檢測線粒體膜電位變化

收集LoVo細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按1×105/孔接種于6孔板.實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍組、質(zhì)量濃度為50 μg/mL的5-FU組和聯(lián)合用藥組(濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍和質(zhì)量濃度為50 μg/mL的5-FU).24 h后棄去原培養(yǎng)液，加藥培養(yǎng)24 h后配置JC-1染色工作液；每孔加入1 mL JC-1染色工作液和1 mL培養(yǎng)液，充分混勻后，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min.孵育結(jié)束后，吸棄上清，用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次.加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，冰浴保存，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞.

1.2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

將LoVo細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中.實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍組、質(zhì)量濃度為50 μg/mL的5-FU組和聯(lián)合用藥組(濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍+質(zhì)量濃度為50 μg/mL的5-FU).待細(xì)胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)液，加藥繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集各組細(xì)胞：收集懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞至離心管中，用預(yù)冷PBS洗滌1次，胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞基本脫落后用培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞至離心管中，將收集的所有細(xì)胞于2 500 r/min離心8 min，棄上清，用預(yù)冷PBS清洗1次.加蛋白裂解液于冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，4 ℃、12 000 r/min離心30 min后提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白質(zhì)量濃度；并將其稀釋至等濃度，與上樣緩沖液混合，95 ℃煮沸5 min至蛋白質(zhì)變性，每組上樣量為50 μg.行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE電泳分離目的蛋白；冰浴條件下轉(zhuǎn)至PVDF膜.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉4 h，稀釋后的一抗(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TPBS洗滌3次，15 min/次；稀釋后的二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶5 000)室溫孵育2 h, TPBS洗滌3次，15 min/次.Immobilion Western HRP 底物發(fā)光液暗室發(fā)光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像.采用Image-J軟件對目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶進(jìn)行灰度值掃描，定量分析目的蛋白的表達(dá)水平.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍和5-FU對LoVo細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的二甲雙胍(0、1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)和不同質(zhì)量濃度的5-FU(0、12.5、25、50、100、200 μg/mL)處理細(xì)胞后，二甲雙胍和5-FU均能抑制LoVo細(xì)胞的體外增殖活性，且隨著藥物濃度及質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05).濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍與不同質(zhì)量濃度的5-FU聯(lián)合干預(yù)LoVo細(xì)胞后，其24、48和72 h的存活率均低于單用5-FU、二甲雙胍組,結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說明二甲雙胍與5-FU聯(lián)合可增強(qiáng)5-FU對LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用(圖1).

2.2 二甲雙胍對5-FU抑制LoVo細(xì)胞增殖的協(xié)同作用

按照聯(lián)合用藥指數(shù)法對MTT原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：采用CompuSyn軟件計(jì)算聯(lián)合用藥的CI值，結(jié)果見圖2.從聯(lián)合指數(shù)概念來講，CI>1 說明藥物間為拮抗作用，CI=1 為相加作用，CI<1 為協(xié)同作用.CI值越小，表示協(xié)同的效應(yīng)越強(qiáng).在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，通常認(rèn)為CI<0.3 表示強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)，0.3

A：不同濃度的二甲雙胍干預(yù)后LoVo細(xì)胞的存活率；B：不同質(zhì)量濃度的5-FU干預(yù)后LoVo細(xì)胞的存活率；C：二甲雙胍、5-FU聯(lián)合干預(yù)后LoVo細(xì)胞的存活率.

A: Viability in LoVo cells treated with metformin at different concentrations; B: Viability in LoVo cells treated with 5-FU at different concentrations; C: Viability in LoVo cells treated with metformin and 5-FU together.

圖1 二甲雙胍、5-FU及兩者合用對LoVo細(xì)胞存活率的影響

Fig.1 Effects of metformin and 5-FU, either alone or in combination, on the LoVo cells viability

A:24 h CI; B:48 h CI; C:72 h CI

圖2 二甲雙胍、5-FU聯(lián)用組 24 h、48 h、72 h聯(lián)合作用指數(shù)

Fig.2 The combined index after combination treatment of 5-FU and metformin for 24, 48 and 72 h

2.3 二甲雙胍和5-FU對LoVo細(xì)胞集落克隆形成的影響

細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單用二甲雙胍或5-FU均可抑制LoVo細(xì)胞集落克隆的形成，兩者合用后對LoVo細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用更明顯，見圖3.

表1 二甲雙胍聯(lián)合不同質(zhì)量濃度的5-FU的CI結(jié)果

A：對照組LoVo細(xì)胞集落克隆的形成；B：二甲雙胍組LoVo細(xì)胞集落克隆的形成；C：5-FU組LoVo細(xì)胞集落克隆的形成D：聯(lián)合用藥組LoVo細(xì)胞集落克隆的形成.1)與對照組比較，P<0.05; 2)與其他3組比較，P<0.05.

A: Colony formation of control group; B: Colony formation of metformin group; C: Colony formation of 5-FU group; D: Colony formation of metformin and 5-FU combination group.1)Compared with control group，P<0.05; 2)Compared with other 3 groups，P<0.05.

圖3 二甲雙胍、5-FU及兩者合用對LoVo細(xì)胞集落克隆形成率的影響

Fig.3 Effects of metformin and 5-FU, either alone or in combination, on colony formation of LoVo cells

2.4 二甲雙胍對5-FU誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖3所示，對照組、二甲雙胍組、5-FU組以及聯(lián)合用藥組24 h LoVo細(xì)胞凋亡率分別為(9.02±0.51)%、(11.79±0.39)%、(16.23±0.46)%、(24.38±0.76)%.其中，與對照組比較，其余各組的凋亡率均明顯升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥組凋亡率明顯高于單獨(dú)用藥組(P<0.05).提示：二甲雙胍和5-FU均可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合用藥組的 LoVo細(xì)胞凋亡更明顯.

2.5 二甲雙胍聯(lián)合5-FU對LoVo細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位的下降在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變.通過JC-1(熒光探針)可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，此轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測指標(biāo).熒光顯微鏡觀察顯示：聯(lián)合用藥組紅色熒光減弱、綠色熒光增強(qiáng)的程度，較對照組和單獨(dú)用藥組的變化更明顯，提示二甲雙胍聯(lián)合5-FU作用于LoVo細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生了早期凋亡，見圖4.

2.6 二甲雙胍聯(lián)合5-FU對誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測Mcl-1、Bcl-2、Bak、Bax蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示：與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組的抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2的表達(dá)下調(diào)更明顯(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bak、Bax則上調(diào)更明顯(P<0.05)(圖6).提示二甲雙胍聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞的凋亡與下調(diào)Mcl-1、Bcl-2和上調(diào)Bak、Bax有關(guān).

1)與對照組比較，P<0.05; 2)與其他3組比較,P<0.05.

圖5 二甲雙胍、5-FU及兩者合用對LoVo細(xì)胞線粒體膜電位的影響(×200)

1)與對照組比較，P<0.05; 2)與其他3組比較,P<0.05.

3 討論

回顧性病例對照研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的結(jié)腸癌發(fā)病率明顯高于非糖尿病患者，說明2型糖尿病與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的某些癌癥的高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[5-6].而在使用一線藥物二甲雙胍治療糖尿病的人群中，胃腸道惡性腫瘤的發(fā)病率較低[7]，且患有結(jié)腸癌的2型糖尿病患者的總生存率提高了40%[8].因此二甲雙胍對癌細(xì)胞的凋亡作用越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注.現(xiàn)今，聯(lián)合不同機(jī)制的抗腫瘤藥物[9]，降低毒副作用和延緩耐藥產(chǎn)生是治療腫瘤的有效手段；進(jìn)一步研究顯示二甲雙胍和部分抗腫瘤藥物聯(lián)合作用時(shí)，可以增強(qiáng)化療藥物的敏感性，但其機(jī)制尚不明確.本實(shí)驗(yàn)觀察了濃度為1.25 mmol/L的二甲雙胍與不同質(zhì)量濃度的5-FU聯(lián)合干預(yù)LoVo細(xì)胞后，其24、48和72 h的存活率均低于5-FU組、二甲雙胍組，說明聯(lián)合用藥組對LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng)；聯(lián)合用藥指數(shù)法分析MTT數(shù)據(jù)得出24、48和72 h兩藥聯(lián)合作用指數(shù)CI<0.7，提示二甲雙胍對5-FU抑制LoVo細(xì)胞增殖的作用有中、強(qiáng)度協(xié)同增敏作用.Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測二甲雙胍聯(lián)合5-FU對LoVo細(xì)胞凋亡影響的結(jié)果表明聯(lián)合用藥組的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于單獨(dú)用藥組.

線粒體跨膜電位下降可作為細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志性事件[10]，主要源于線粒體內(nèi)膜的通透性增加[11]：線粒體生成了由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)外膜接觸位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)的通透性轉(zhuǎn)變孔道[12](PT孔道).JC-1是廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針[13]，通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化.當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1主要以紅色熒光聚集體存在于線粒體基質(zhì)中；線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，而主要以綠色熒光單體形式存在.從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變提示線粒體跨膜電位的下降.本研究的JC-1檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍與5-FU的聯(lián)合用藥組紅色熒光減弱、綠色熒光增強(qiáng)的程度更明顯，說明聯(lián)合用藥組LoVo細(xì)胞的凋亡更明顯.

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的中樞，是細(xì)胞凋亡調(diào)控的核心部位.Bcl-2蛋白家族主要定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[14]，是線粒體凋亡途徑和細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15].根據(jù)同源性基序(BH)和功能,其可分為抗凋亡蛋白(BH1-BH4)、促凋亡蛋白(BH1-BH3)和促凋亡BH3-only蛋白[16].正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白(Bcl-2、Mcl-1)和促凋亡蛋白(Bak、Bax)存在相互作用，可控制MOMP[17](線粒體外膜透化作用)；在細(xì)胞接收凋亡刺激后，Bcl-2[18]、Mcl-1等抗凋亡蛋白與BH3-only蛋白結(jié)合而失活，促使Bak、Bax等促凋亡蛋白釋放[19-20]，這些促凋亡蛋白通過同源寡聚化在線粒體外膜上形成PT孔道并釋放細(xì)胞色素c，從而引起半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21]，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.在許多人類腫瘤如胃腸道腫瘤(結(jié)腸癌等)中，存在Bcl-2、Mcl-1過度表達(dá)的現(xiàn)象，而高表達(dá)的Bcl-2、Mcl-1可抑制細(xì)胞凋亡[22-23].因此Bcl-2、Mcl-1、Bak、Bax 在線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.為了進(jìn)一步闡明凋亡分子機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組的抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表達(dá)的下調(diào)更明顯，而促凋亡蛋白Bak、Bax的上調(diào)更明顯，提示二甲雙胍促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)的LoVo細(xì)胞凋亡與下調(diào)Mcl-1、Bcl-2和上調(diào)Bak、Bax有關(guān).

綜上所述，本研究證實(shí)了二甲雙胍對人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用，并且能夠明顯增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用.其機(jī)制可能與下調(diào)Mcl-1、Bcl-2和上調(diào)Bak、Bax的表達(dá)有關(guān)，但其具體機(jī)制有待深入探討.