紅松種子園種群表型多樣性研究

童躍偉,唐 楊,陳 紅,張 濤,左 江,吳 健,周 莉,周旺明,于大炮,代力民,*

1中國科學(xué)院森林生態(tài)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所),沈陽 110016 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 黑龍江省重點(diǎn)國有林管理局,虎林 158402 4 吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院,長春 130022

遺傳多樣性為物種涵蓋的種群間和種群內(nèi)個(gè)體間遺傳變異的總和,包括表型、細(xì)胞學(xué)、生化和分子等多層次遺傳變異[1]。其中表型是各種形態(tài)特征的組合,是生物受制于生態(tài)環(huán)境條件的遺傳變異的表征[2],其表型變異是遺傳多樣性研究的重要內(nèi)容[3-4]。同時(shí),利用表型性狀研究遺傳多樣性也最為簡便、快速和經(jīng)濟(jì), 可以直觀的揭示種群的遺傳結(jié)構(gòu)與變異大小, 是遺傳育種工作的基礎(chǔ)[5-6]。國內(nèi)外學(xué)者利用表型性狀對思茅松[7]、五角楓[8]、云南松[9]、閩楠[10]、擬南芥[11]等植物種群進(jìn)行了遺傳多樣性分析與評價(jià), 闡明了種群變異結(jié)構(gòu)、來源和規(guī)律,為相關(guān)樹種的資源收集、保護(hù)或遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)隸屬于松科(Pinaceae)松屬(Pinus),是我國東北珍貴而稀少的常綠喬木[12]。近百年來,由于過量采伐紅松天然林,致使紅松資源銳減[13],已被國家二級保護(hù)植物[14]。因此,為保護(hù)紅松種質(zhì)資源,國家從20世紀(jì)80年代中期開始在東北地區(qū)不同區(qū)域建立紅松種子園(例如露水河紅松種子園)[15],然而,這批種子園的建園材料是只經(jīng)過表型性狀初選的優(yōu)樹,其選育的遺傳基礎(chǔ)鮮有報(bào)道。以往有人利用分子技術(shù)從遺傳多樣性方面進(jìn)行了這方面的研究[16- 18],但從表型性狀方面還未開展過相關(guān)研究。因此,本研究采用表型性狀,針對種子園收集的不同區(qū)域紅松的遺傳多樣性進(jìn)行評估,為以后紅松種子園資源收集和育種策略提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

吉林省露水河紅松種子園,位于東經(jīng)127°47′,北緯42°28′,海拔760—800 m,屬季風(fēng)性中溫帶氣候類型。該紅松種子園于1988年定植,種子園內(nèi)紅松由小興安嶺、完達(dá)山、張廣才嶺和長白山地區(qū)共17個(gè)種源地的優(yōu)良無性系組成。采用完全隨機(jī)排列設(shè)計(jì),株行距3 m×3 m,建成紅松無性系種子園1個(gè)大區(qū),17個(gè)小區(qū),共660個(gè)無性系,面積16.33 hm2。

1.2 材料來源和樣品采集

于2017年8月和10月對種子園內(nèi)6個(gè)種群紅松的完整葉片和成熟球果進(jìn)行采集和形態(tài)數(shù)據(jù)測定工作。采樣種群的原產(chǎn)地分別為：吉林省露水河和黃泥河;黑龍江省大海林、東方紅、帶嶺和豐林,該6個(gè)種群代表了我國紅松不同的自然分布區(qū),而且能反映出分布區(qū)的特點(diǎn)(圖1)。每種群選取30個(gè)單株進(jìn)行調(diào)查和采樣,單株間距50 m以上,保證取樣均勻性,最大限度降低母樹間的親緣關(guān)系。

圖1 種子園紅松6個(gè)種群的原產(chǎn)地分布圖Fig.1 Map illustrating the original location of six Pinus koraiensis populations in the seed orchard

1.3 表型性狀的測定

從采樣單株上隨機(jī)采集并測量無病蟲害、生長旺盛、完整的兩年生針葉10束和成熟的球果10個(gè),選擇了15個(gè)易于獲取和測定的遺傳上相對穩(wěn)定的表型性狀,用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)分別測定并記錄紅松的針葉長(NL)、針葉粗(NW)、針葉束粗(FW)、球果長(CL)、球果寬(CD)、種子長(SL)、種子寬(SD),用電子天平(精確到0.01g)分別稱量單個(gè)球果重量(CW)、單果產(chǎn)種量(CSY)和百粒重(HSW),其中百粒重隨機(jī)3次重復(fù)測量100粒種子,然后計(jì)算出針葉長/針葉粗(NL/NW) 、針葉束粗/針葉粗(FW/NW)、球果長/球果寬(CL/CD)、產(chǎn)種率(CSY/CW) 和種子長/種子寬(SL/SD),精確到0.01。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

紅松種群的表型變異特征采用巢式設(shè)計(jì)方差分析[1, 3],線形模型為:Yijk=μ+Si+T(i)j+(ij)k,式中Yijk為第i個(gè)種群第j個(gè)個(gè)體第k個(gè)觀測值,μ為總均值,Si為種群效應(yīng)(固定),T(i)j為種群內(nèi)個(gè)體效應(yīng)(隨機(jī)),(ij)k為試驗(yàn)誤差。同時(shí)進(jìn)行多重比較和差異性檢驗(yàn), 分別計(jì)算6個(gè)種群各個(gè)性狀的平均值(X)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、和變異系數(shù)(CV),CV=SD/X。為了與基因分化系數(shù)(Gst)相對應(yīng),按下式計(jì)算出了反映種群間表型分化的值定義：Vst=(2t/s)/ (2t/s+2s),式中2t/s為種群間方差分量、2s為種群內(nèi)方差分量,Vst為表型分化系數(shù),表示種群間變異占遺傳總變異的百分比,表明表型變異在種群間貢獻(xiàn)的大小[19]?；?5個(gè)性狀數(shù)據(jù),對6個(gè)紅松種群進(jìn)行非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析[20]。

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016整理后, 巢式方差分析、表型性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)、差異性檢驗(yàn)和多重比較和表型分化系數(shù)均在R 3.2.5中完成,聚類分析在SPSS19.0中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 種群間和種群內(nèi)的表型變異

對種子園紅松6個(gè)種群15個(gè)表型性狀進(jìn)行巢式設(shè)計(jì)方差分析(表1),紅松15個(gè)表型性狀在種群間和種群內(nèi)均差異顯著(P<0.01),表明紅松的表型性狀在種群間和種群內(nèi)存在廣泛的變異。對各種群均值進(jìn)行Turkey ′s多重比較,發(fā)現(xiàn)紅松15個(gè)表型性狀在種群間存在廣泛的變異,但不同性狀在各種群間變異式樣不同(表2)。針葉性狀中NL、NW和FW在種群間差異顯著,露水河種群最大,分別為12.65 mm、0.99 mm、2.02 mm；東方紅種群NL最小,僅為11.1 mm；帶嶺種群的NW和FW最小。NL/NW和FW/NW代表針葉的葉型指數(shù),這兩種性狀最大的是帶嶺種群,分別為 14.24和2.08。6個(gè)球果性狀中CL、CD和CL/CD在種群間的差異都較小,變異的范圍分別為14.27—15.35 cm、9.46—10.04 cm和1.42—1.56；然而CW和CSY這兩個(gè)球果的質(zhì)量性狀在種群間的差異較大,露水河種群最大,分別為298.33 g和89.13 g；帶嶺種群最小,分別為235.99 g和68.9 g。CSY/CW變異范圍為28.77—34.03。同時(shí), 紅松4個(gè)種子性狀在種群間的差異也較小,SL、SD和HSW均值最大的是露水河種群(17.29 mm、11.29 mm和69.93 g)。

從各種群的地理分布來看,不同性狀在種群間多表現(xiàn)為顯著性差異。在所測的15個(gè)表型性狀中,露水河種群在其中10個(gè)表型性狀均值上表現(xiàn)出最高值,其位置為最南端,即緯度最低；而在6個(gè)種群中出現(xiàn)低值的種群則比較分散。

2.2 表型性狀的分化

根據(jù)巢式方差分析結(jié)果,各性狀方差分量和表型分化系數(shù)分析見表3,15個(gè)表型性狀種群間的方差分量占總變異的百分比波動(dòng)于0.62%—29.95%,平均為9.28%；種群內(nèi)的方差分量占總變異的百分比為31.81%—89.07%,平均為65.11%；隨機(jī)誤差的方差分量百分比為9.03%—67.57%,平均為25.61%。各性狀種群內(nèi)的方差分量均大于種群間的方差分量,說明種群內(nèi)的變異是紅松表型總變異的主要部分。

表1 紅松種子園種群間和種群內(nèi)方差分析結(jié)果

NL: Needle Length; NW: Needle Width; FW: Fascicle Width; NL/NW: Ratio of Needle Length to Needle Width; FW/NW: Ratio of Fascicle Width to Needle Width; CL: Cone Length; CD: Cone Diameter; CL/CD: Ratio of Cone Length to Cone Diameter; CW: Cone Weight; CSY: Seed Yield of Cone; CSY/CW: Ratio of Seed Yield of Cone to Cone Weight; SL: Seed Length; SD: Seed Diameter; SL/SD: Ratio of Seed Length to Seed Diameter; HSW: Hundred Seed Weight.

表2 種子園6個(gè)紅松種群間表型性狀的平均值及其多重比較(Turkey,a=0.05)

Table 2 The mean value, standard deviation and multi-comparison of phenotypic traits among sixP.koraiensispopulations in seed orchard(Turkey,a=0.05)

表型性狀Phenotypic traits露水河黃泥河大海林東方紅帶嶺豐林針葉長(NL)/cm12.65±1.36c11.41±1.11ab11.33±1.33ab11.1±1.36a11.47±1.62b11.52±1.56b針葉粗(NW)/mm0.99±0.12d0.91±0.11b0.94±0.12c0.91±0.1b0.81±0.11a0.83±0.11a針葉束粗(FW)/mm2.02±0.21d1.87±0.2b1.95±0.23c1.87±0.19b1.68±0.17a1.69±0.2a針葉長/針葉粗(NL/NW)12.84±1.33c12.66±1.53bc12.11±1.31a12.34±1.46ab14.24±2.05d13.97±2.08d針葉束粗/針葉粗(FW/NW)2.04±0.13a2.07±0.17ab2.07±0.14ab2.08±0.16ab2.08±0.22b2.05±0.2ab球果長(CL)/cm15.35±1.55b14.7±1.74ab14.59±1.45a14.67±1.55a14.27±1.92a14.63±1.76a球果寬(CD)/cm10.04±0.6b9.46±1.06a9.88±0.62b9.97±0.76b10.03±0.87b9.96±0.92b球果長/球果寬(CL/CD)1.53±0.13c1.56±0.14c1.48±0.11b1.47±0.1b1.42±0.12a1.47±0.14ab球果重(CW)/g298.33±65.74c250.83±72.6ab245.92±62.15ab269.29±66.21b235.99±78.62a237.01±72.57a單果產(chǎn)種量(CSY)/g89.13±27.82b77.62±21.68ab81.82±18.33bc83.65±22.14bc68.9±29.27a78.35±30.09ac產(chǎn)種率(CSY/CW)29.48±5.76a31.23±3.96ab34.03±6.44b31.45±5.79ab28.77±8.48a32.45±7.62b種長(SL)/mm17.29±0.92b16.31±1.4a17.07±1.05b16.11±0.11a16.9±1.31b17.25±1.46b種寬(SD)/mm11.29±0.85b11.21±0.88ab10.96±0.88a10.93±0.9a11.0±0.93a10.94±1.06a種長/種寬(SL/SD)1.54±0.13b1.46±0.12a1.56±0.12b1.48±0.12a1.54±0.14b1.58±0.13b百粒重(HSW)/g69.93±7.25b62.65±11.84a64.63±8.8a65.32±9.24a65.64±10.7ab64.43±13.49a

同時(shí),針葉、球果和種子性狀Vst的變異幅度為0.95%—35.67%,15個(gè)表型性狀的平均表型分化系數(shù)為12.39%,說明紅松種子園種群表型變異在種群間的貢獻(xiàn)占12.39%,種群內(nèi)貢獻(xiàn)占87.61%,種群內(nèi)多樣性大于種群間多樣性。其中表型分化系數(shù)最大的性狀為FW,為35.67%；其次為NW,為33.27%,最小的為FW/NW,為0.95%,15個(gè)表型性狀均表現(xiàn)為種群間的表型分化系數(shù)低于50%,說明紅松種子園種群表型變異主要存在于種群內(nèi)。

表3 紅松種子園種群表型性的方差分量及表型分化系數(shù)

2.3 表型性狀的變異特征

不同性狀在6個(gè)種群中的變異情況有顯著差別(表4),各性狀在種群內(nèi)的總平均變異系數(shù)為13.28%,變幅為6.16%—31.48%,在15個(gè)表型性狀中球果單果產(chǎn)種量的變異系數(shù)最大(CV=31.48%),其次為單果的球果重和出種率,變異系數(shù)分布為27.46%和20.42%,這3個(gè)性狀變異程度明顯高于其他性狀,表明球果性狀的質(zhì)量性狀變異較其他性狀變異大,較其他性狀的穩(wěn)定性差。此外,分別計(jì)算紅松種群內(nèi)針葉、球果和種子3個(gè)生物學(xué)性狀的平均變異系數(shù),得出球果的平均變異系數(shù)最大(CV=17.86%)、其次為針葉性狀 (CV=11.19%),種子性狀的變異系數(shù)最小(CV=9.87%),進(jìn)一步說明種子性狀較其他性狀的穩(wěn)定性高,而球果性狀的穩(wěn)定性最差。

表4 紅松6個(gè)種群表型性狀的變異系數(shù)(CV)

圖2 種子園紅松6個(gè)種群15表型性狀的聚類樹形圖Fig.2 UPGMA cluster based on 15 phenotypic traits of six P. koraiensis populations

此外,種子園紅松同一性狀在不同種群間的變異系數(shù)也有一定差異,平均變異系數(shù)范圍為11.79%—15.77%,帶嶺和豐林種群的性狀平均變異系數(shù)要高于其他種群,說明帶嶺和豐林種群的表型多樣性程度高于其他種群。由于種子園地處相同的環(huán)境,因此可以說明的是種子園不同種群的基因型不同,從而導(dǎo)致了種群表型變異的差異。因此,可以推斷出帶嶺和豐林地區(qū)的紅松基因型的多樣性也高于其他種群。

2.4 表型性狀的聚類分析

采用歐式平均距離UPGMA聚類方法對6個(gè)種群的15個(gè)表型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析(圖2),當(dāng)歐式平均距離的閾值為2時(shí),6個(gè)種群明顯分化為4類,第一類為露水河種群,第二類為東方紅種群,第三類為黃泥河種群和大海林種群,第四類為帶嶺和豐林種群。聚類結(jié)果與種子園6個(gè)種群的地理距離相一致,聚類出4大類群與我國東北地區(qū)地形有一定程度的契合,露水河種群隸屬長白山山脈,東方紅種群為完達(dá)山山脈,黃泥河和大海林種群屬于張廣才嶺山脈,而帶嶺和豐林種群坐落于小興安嶺山脈,當(dāng)從而驗(yàn)證了山脈形成地理隔離,從而導(dǎo)致物種遺傳變異和分化的理論。

3 結(jié)論與討論

3.1 紅松不同種群表型變異來源

通過對露水河種子園的6個(gè)種群的針葉、球果和種子的15個(gè)表型性狀的研究發(fā)現(xiàn),紅松的表型性狀在種群間和種群內(nèi)都存在極顯著的差異。這種變異在松樹中廣泛存在,如海岸松[21]、歐洲赤松[22]、思茅松[7]等,顯著的表型差異暗示紅松存在豐富的遺傳變異。表型變異的結(jié)論與諸多遺傳多樣性的分析結(jié)論一致,即紅松種群遺傳多樣性比較豐富[23- 25],李斌等對松屬植物遺傳分化進(jìn)展的研究得出了相似的結(jié)果[4]。

紅松15個(gè)表型性狀的平均分化系數(shù)Vst=12.39%,說明種群內(nèi)變異(87.61%)顯著高于種群間變異(12.39%),種群內(nèi)變異是紅松的主要變異來源,這反映了種群G×E的復(fù)雜性及其適應(yīng)特殊環(huán)境選擇壓的廣泛程度,由于種子園6個(gè)紅松種群地處相同的生態(tài)環(huán)境,故其表型性狀之間的變異主要是來源于遺傳方面所造成。與其他針葉樹種的分化比較,紅松表型性狀的分化處于中等水平,高于西特喀云杉(10.1%)[26]、花旗松(11.1%)[27]和馬尾松(6.44%)[19],卻低于油松(38.97%)[28]、云南松(25.27%)[9]和白皮松(22.86%)[3]等。有研究表明,紅松的繁育系統(tǒng)可能是紅松種群內(nèi)變異的主要來源,繁育系統(tǒng)是影響物種種群遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素,尤其是交配系統(tǒng)和基因流[29]。例如,針葉樹花粉的遷移距離很大,外部花粉(基因)的遷入減少了種群間的差異[30]；典型的異花授粉植物的交配系統(tǒng)可以促進(jìn)種群間的基因交流,增加有效種群大小,減少基因漂變對遺傳結(jié)構(gòu)的影響[29]；紅松為風(fēng)媒異花授粉的裸子植物,具備遠(yuǎn)距離擴(kuò)散種子的可能,可以促進(jìn)基因流的流動(dòng),從而減少種群間的差異[31]。盡管種群內(nèi)的變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種群間的變異,但種群間變異的意義卻大于種群內(nèi)變異,因?yàn)榇嬖谟诜N群間的變異反映了地理、生殖隔離上的變異,種群間的多樣性變異是種內(nèi)多樣性的重要組成部分[32]。

3.2 紅松不同種群表型變異特征

植物種群中變異系數(shù)是衡量各觀測值離散程度的統(tǒng)計(jì)量,變異系數(shù)的大小可間接反映出種群的表型多樣性豐富程度,即變異系數(shù)大說明該種群的性狀變異幅度高,表型多樣性豐富,可能存在的遺傳變異越豐富,種群內(nèi)多種基因型所對應(yīng)的表型范圍越廣,可以使種群整體更加適應(yīng)環(huán)境的變化[33]。本研究中紅松15個(gè)表型性狀中的變異系數(shù)幅度為6.16%—31.48%,平均 13.28%,變化范圍較大,說明紅松種群內(nèi)表型性狀遺傳變異較豐富。其中球果變異系數(shù)(17.86%) >針葉變異系數(shù)(11.19%) >種子變異系數(shù) (9.87%),可以看出營養(yǎng)性狀的變異水平大于繁殖性狀的變異水平,營養(yǎng)性狀變異更豐富。研究表明,環(huán)境變化容易引起植株的高矮、葉片的長短等營養(yǎng)性狀的變化,而繁殖器官的變異則經(jīng)歷了較為復(fù)雜的發(fā)育分化后改變較少,環(huán)境的不同是導(dǎo)致營養(yǎng)器官變異的主要原因[8]。紅松種子的穩(wěn)定性最大,在一定程度上可以反映紅松遺傳變異的程度越小,紅松種子是傳遞遺傳物質(zhì)的載體,變異較小,穩(wěn)定性較高,受到環(huán)境影響較小。同時(shí),單個(gè)球果重量、單果產(chǎn)種量和百粒重的變異幅度明顯大于其他表型性狀,這3個(gè)表型性狀有可能主導(dǎo)紅松發(fā)生表型變異的方向,球果質(zhì)量和千粒重對植物的成功定居有重要的影響[34]。

3.3 紅松不同種群表型分化的地理變異規(guī)律

種群的分布以及UPGMA聚類結(jié)果表明,紅松表型按照地理距離而聚類,聚類出的4四大類群與我國東北地區(qū)地形有一定程度的契合,帶嶺和豐林種群、黃泥河和大海林種群分布區(qū)域距離較近,且分別屬于小興安嶺山脈和張廣才嶺山脈,東方紅種群屬于完達(dá)山山脈,露水河種群屬于長白山山脈,因而利用地理區(qū)劃對紅松表型進(jìn)行劃分是可行的。一般來說植物表型性狀的地理變異規(guī)律比較復(fù)雜,幾乎都是由環(huán)境和基因型共同決定的,因物種的不同而異,如野生玫瑰表型性狀主要依地理位置而聚類[35],而五角楓性狀的表型特征沒有依地理距離而聚類[8]；川西云杉表現(xiàn)出以經(jīng)度和緯度并存的變異模式[36],而浙江楠卻呈現(xiàn)出以海拔變異為主的梯度規(guī)律性[5]。但本研究所選的6個(gè)種群已經(jīng)排除了環(huán)境因素的干擾,其山脈劃分的依據(jù)主要是遺傳方面即基因型不同導(dǎo)致的原因。種子園6個(gè)紅松種群的產(chǎn)地中,地處相同山脈的水熱條件極為相似,基因交流還能正常進(jìn)行；而在不同山脈間已經(jīng)產(chǎn)生地理隔離,造成基因交流障礙,突變成不同的基因型,因此紅松表型性狀表現(xiàn)出以山脈變異的規(guī)律性。另外,本研究結(jié)果在利用分子手段研究紅松的遺傳變異方面得到了驗(yàn)證,如紅松各種源在遺傳多樣性方面的差異與其地理分布明顯相關(guān),其中小興安嶺種群的遺傳多樣性較高,且與張廣才嶺種群遺傳距離較近,而與長白山種群和老爺嶺種群遺傳距離較遠(yuǎn)[24, 37]。但也有研究認(rèn)為紅松不同種源的遺傳距離和地理距離相關(guān)性不明顯,造成這一現(xiàn)象的原因是與紅松不同種群分布區(qū)特定的地理、氣候等因子有關(guān),地理距離相近的種群之間可能存在某種特定的隔離機(jī)制,阻礙基因交流；此外,還可能與種群之間不同的形成機(jī)制和演化歷史有關(guān)[17, 25]。因此,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 紅松保護(hù)對策與建議

紅松為我國二級保護(hù)珍貴用材樹種,通過長期的地理隔離、自然選擇和人工選擇,產(chǎn)生了極其豐富的表型變異,這些表型性狀的變異都是基因型和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果,表型變異越大,可能存在的遺傳變異就越大。目前,由于紅松天然林面積不斷減少,破壞極為嚴(yán)重,因此就紅松的保護(hù)和發(fā)展提出如下建議：(1) 本文結(jié)論之一就是紅松種群遺變異比較豐富,在松屬植物中屬于中等水平。因此加強(qiáng)現(xiàn)有天然林的保護(hù),禁止采伐天然林保留林木,同時(shí)保護(hù)其生境,對維持紅松遺傳多樣性水平至關(guān)重要；(2) 根據(jù)本文中紅松15個(gè)表型性狀在種群間和種群內(nèi)均存在著極顯著的差異,并且遺傳變異主要存在于種群內(nèi)的結(jié)論,應(yīng)以種群為單位,開展紅松種群生態(tài)遺傳學(xué)研究,分析紅松種群的遺傳多樣性,結(jié)合分子生物學(xué)分析紅松瀕危的關(guān)鍵因子和瀕危過程；(3) 帶嶺和豐林種群表型性狀遺傳多樣性要高于其他種群,因此可選擇一定數(shù)量的林分優(yōu)先進(jìn)行原地保存,同時(shí)利用與異地保存相結(jié)合的手段,營建紅松母樹林、種子園和收集圃等,從而對紅松基因庫保存提供有利保障。