電針對血管性癡呆大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)海馬區(qū)MAPK通路的影響*

馬 莉，封 宇，艾莉偉△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是與腦血管損傷相關(guān)的血管性認(rèn)知障礙綜合征中的癡呆亞型。血管性癡呆約占癡呆總患病率的30%，是老年人發(fā)生癡呆最常見的原因之一[1]，其發(fā)病機(jī)理與治療手段目前尚無明確指南[2]。VD的最常見病因是缺血性卒中，而神經(jīng)元的凋亡是腦缺血引發(fā)腦組織損害的重要原因之一。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)信號通路是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞生長因子和促有絲分裂物質(zhì)做出反應(yīng)，把細(xì)胞外信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[3]。MAPK家族中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的突觸可塑性在形態(tài)和功能上的修飾，可以影響到神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、損傷修復(fù)以及學(xué)習(xí)記憶等多種腦功能[4]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路的激活則主要介導(dǎo)炎癥及應(yīng)急反應(yīng)中的細(xì)胞凋亡[5]。通過臨床觀察可發(fā)現(xiàn)，電針治療可改善血管性癡呆患者的認(rèn)知與學(xué)習(xí)記憶能力[6]。本研究以血管性癡呆大鼠為模型，觀察了電針調(diào)節(jié)對MAPK通路中ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38及Bcl-2、Bax指標(biāo)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 純系Wistar健康雄性大鼠60只，18～20月齡，體質(zhì)量為(500±20)g，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 一次性無菌針灸針，直徑0.25 mm×25 mm(貴州安迪藥械有限公司)；腦復(fù)康吡拉西坦片0.4 g(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；KWD-808Ⅰ脈沖電針儀(常州市武進(jìn)長城醫(yī)療器械有限公司)；大鼠程控穿梭箱DCS-2型(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；兔抗Phospho-p44/p42 MAPK(Erk1/2)Antibody、兔抗p44/p42 MAPK(Erk1/2)Antibody、兔抗p38 MAPK Antibody、兔抗Phospho-p38 MAPK Antibody、兔抗GAPDH(美國CST公司)；兔抗Bcl-2、Bax 、HRP-羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 造模方法

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后，隨機(jī)分組法分為模型組、假手術(shù)組、電針組、西藥組4組，每組各15只。采用分次結(jié)扎頸總動脈法造模，即改進(jìn)的2-VO法[7]：術(shù)前12 h禁食水，小容器乙醚棉球罩頭麻醉，保證術(shù)間自主呼吸，消毒，一側(cè)頸總動脈上方處切開，鈍性分離該側(cè)頸總動脈及神經(jīng)，以4號絲線雙重結(jié)扎，縫合切口。7天后行另一側(cè)結(jié)扎，與上法相同。放回籠中保溫飼養(yǎng)，術(shù)后大鼠肌內(nèi)注射青霉素20萬單位，連續(xù)5天，以防感染。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈后縫合。

1.3 治療方法

待術(shù)后7天，傷口完全愈合后進(jìn)行治療。電針組按照于致順老師頭穴針法，分別于VD大鼠頭部從額區(qū)神庭至囟會(參照《實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜》及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》)及其左右各1寸、2寸的平行線處叢刺，各5針，將左右最外側(cè)兩針連接電針儀，波形選用疏密波，頻率2 Hz，大鼠耳部輕微顫抖為度，持續(xù)20 min，電針結(jié)束后留針30 min，每日1次。西藥組術(shù)后7天，給予濃度為40 mg/mL的腦復(fù)康水溶液灌胃，每日1次。余兩組分別給予等量生理鹽水灌胃，每日1次。4組均于3天后停止治療。

1.4 行為學(xué)測試

各組大鼠治療前及治療后均進(jìn)行穿梭箱實(shí)驗(yàn)，測評4組大鼠的行為學(xué)變化。將大鼠先移入實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)性訓(xùn)練3 min，測試時(shí)間為5 min。實(shí)驗(yàn)開始后，當(dāng)電源開啟發(fā)出蜂鳴聲后，穿梭箱底部左側(cè)通電，遭受電刺激的大鼠被動逃避至穿梭箱右側(cè)；再次警鳴后，穿梭箱底部右側(cè)通電，大鼠被電刺激被動逃避至左側(cè)。重復(fù)上述步驟，大鼠聽到警鳴后主動逃避，即從一側(cè)逃至另一側(cè)。實(shí)驗(yàn)記錄儀分別記錄下大鼠遭受電擊次數(shù)與電擊時(shí)間等。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)試驗(yàn)

穿梭箱實(shí)驗(yàn)后，各組大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)以10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉，開胸暴露心臟后用0.9%生理鹽水和4%PBS緩沖液快速沖洗灌注。參照孫曉彩等的方法[5]分離取出雙側(cè)海馬CA1區(qū)組織，碾碎裂解提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%脫脂奶粉封閉，室溫下孵育1 h，與一抗兔抗ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、Bcl-2、Bax(1∶1 000)及內(nèi)參GAPDH(1:1 000)4℃孵育過夜，后滴加羊抗兔二抗孵育60 min，TEST洗膜，ECL顯色曝光，將所得底片掃描存檔，并用Image-Pro Plus進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間樣本均數(shù)的比較用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)檢測比較

表1結(jié)果顯示：治療前，與模型組相比假手術(shù)組電擊次數(shù)與電擊時(shí)間顯著降低(P<0.05)，說明造模成功。治療后，與模型組相比電針組、西藥組均能夠降低電擊次數(shù)與電擊時(shí)間(P<0.05)，提示兩種治療手段對VD大鼠病情均有改善；西藥組與電針組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠行為學(xué)結(jié)果比較

注：與模型組對比，*P<0.05；與電針組對比，▼P>0.05。

2.2 各組凋亡通路蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)比較

圖1、表2結(jié)果顯示：假手術(shù)組中與模型組比較大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2與Bax均有一定量蛋白表達(dá)。假手術(shù)組與模型組相對比,Bcl-2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，假手術(shù)組中Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。電針組、西藥組與模型組相對比,電針組與西藥組中的Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；電針組與西藥組兩之間比較Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)

2.3 各組MAPK/ERK通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38表達(dá)比較

圖2、表3結(jié)果顯示,VD模型組大鼠海馬CA1區(qū)ERK1/2與p38的蛋白總表達(dá)無明顯變化。假手術(shù)組與模型組比較p-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，假手術(shù)組中p-p38蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。電針組、西藥組與模型組比較：電針組、西藥組的p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，p-p38蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；西藥組與電針組比較，西藥組的p-ERK1/2、p-p38蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)比較

注：與模型組對比，*P<0.05,△P>0.05；與電針組對比，▼P>0.05。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38的蛋白表達(dá)

組別ERK1/2/GAPDHp-ERK1/2/GAPDHp38/GAPDHp-p38/GAPDH假手術(shù)組1.15±0.130.37±0.26△0.75±0.210.11±0.04?模型組1.21±0.180.39±0.220.81±0.190.39±0.10電針組1.19±0.200.84±0.17?0.78±0.130.18±0.07?西藥組1.22±0.210.86±0.19?▼0.79±0.110.17±0.05?▼

注：與模型組對比，*P<0.05,△P>0.05；與電針組對比，▼P>0.05。

3 討論

血管性癡呆(VD)在中醫(yī)學(xué)屬于“癡呆”“呆病”“中風(fēng)”范疇，病位在腦?！鹅`樞·海論》即有記載：“腦為髓之海，其輸上在于其蓋，下在風(fēng)府。”又“……髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥?！蔽以河谥马樌蠋熗ㄟ^選取頭部體表及其周圍腧穴或功能區(qū)治療腦源性疾病[8]。近年來電針治療因其療效明顯，方法簡便，于臨床應(yīng)用廣泛。評估嚙齒類動物學(xué)習(xí)記憶能力，常用可定量描述實(shí)驗(yàn)大鼠主動回避反應(yīng)等特征的行為學(xué)測量工具穿梭箱來進(jìn)行[9]。本實(shí)驗(yàn)中采取電針治療VD大鼠額區(qū)，通過穿梭箱實(shí)驗(yàn)檢測，證實(shí)了電針對于大鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)能力的提升。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是造成血管性癡呆的認(rèn)知障礙的重要因素，如何通過治療手段來調(diào)節(jié)細(xì)胞的動態(tài)凋亡過程，以增加細(xì)胞存活率是當(dāng)前重要研究方向。研究發(fā)現(xiàn)針刺可通過調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)含量及其他誘發(fā)細(xì)胞凋亡因素起到療效[10]。Zuowei L等發(fā)現(xiàn)早期進(jìn)行針刺干預(yù)與Bcl-2和Bax基因表達(dá)有關(guān)，這兩個(gè)基因表達(dá)的變化與其陽性細(xì)胞數(shù)的變化一致，而表達(dá)率的變化與Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)量變化正相關(guān)，而Bax基因表達(dá)的變化則與之相反[11]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一系列相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能。MAPK由4個(gè)亞家族組成：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2，也稱為p44/p42)；jun-NH2-末端激酶1/2(JNK1/2，也稱為應(yīng)激激活蛋白激酶或p54/p46)；p38 MAPK和ERK5[12]，這些信號通路參與介導(dǎo)腦缺血損傷中神經(jīng)細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞凋亡分化[13]。研究證明ERK1/2被激活磷酸化后在下游發(fā)揮作用，通過調(diào)節(jié)抗凋亡或促凋亡途徑Bcl-xL、Bax和AIF的表達(dá)，來抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和梗塞體積[14]。楊忠華等的研究表明，p-ERK1/2的高表達(dá)可能只限于缺血缺氧的早期[15]。而p-p38長期活化參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16]，p-p38抑制劑促進(jìn)體外多種神經(jīng)元的存活[17]。p38的激活會阻礙ERK1/2的保護(hù)性通路，從而導(dǎo)致凋亡[18]。細(xì)胞凋亡是生物發(fā)育過程中的必經(jīng)之路，同時(shí)存在于生理和病理過程中。可見，ERK1/2與p38MAPK之間通過動態(tài)平衡來調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[19]，若此動態(tài)平衡失衡則可能加速細(xì)胞凋亡。p-ERK 1/2和p-p38的動態(tài)調(diào)節(jié)在血管性癡呆疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,治療后血管性癡呆模型組大鼠的行為學(xué)檢測中電擊次數(shù)和電擊時(shí)間明顯多于治療前模型組，表明治療有效；而經(jīng)過額區(qū)電針治療的電針組VD大鼠行為檢測結(jié)果明顯優(yōu)于模型組，免疫印跡試驗(yàn)中因GAPDH在組織中表達(dá)恒定，故被廣泛用作細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，通過將目的蛋白含量與樣本GAPDH含量相除來矯正誤差。其結(jié)果顯示經(jīng)電針治療后Bax蛋白表達(dá)率比模型組明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)率明顯升高，證明電針治療有對神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有抑制作用。WB實(shí)驗(yàn)中，ERK1/2、p38蛋白表達(dá)量在假手術(shù)組、模型組、電針組及西藥組4組的表達(dá)大致相同，而電針組與模型組相比p-ERK1/2升高而p-p-38 MAPK降低，證明了通過調(diào)控磷酸化的ERK1/2、p38的表達(dá)，電針和西藥均對VD大鼠的治療效果顯著。研究表明，針灸影響VD病理過程的多個(gè)方面，其通過保護(hù)大腦神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和神經(jīng)遞質(zhì)來改善認(rèn)知功能。針灸還可以改善突觸可塑性和血管功能[20]。并由此推測，電針治療可調(diào)控MAPK通路使其磷酸化，通過升高p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平和降低p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平，抑制大鼠海馬區(qū)CA1神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了神經(jīng)元功能的恢復(fù)。而電針組和西藥組的治療效果無明顯差別，但電針由于其無副作用、操作簡便，故綜合評比優(yōu)于西藥組。

綜上所述，額區(qū)電針治療對血管性癡呆具有腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能上調(diào)表達(dá)p-ERK1/2蛋白，下調(diào)表達(dá)p-p38MAPK蛋白有關(guān)，動態(tài)調(diào)節(jié)了兩條信號通路，從而通過降低神經(jīng)元的壞死來發(fā)揮腦保護(hù)功能。而ERK、p38的動態(tài)平衡是維持及調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的重要條件。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用電針治療血管性癡呆提供了理論依據(jù)，也為該病的研究與治療提供了新的思路。