天麻素穴位注射對(duì)戊四氮致癇模型大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)凋亡調(diào)控因子Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響*

肖 飛，劉 鵬，程光宇，畢海洋，于楠楠

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇(epilepsy)為神經(jīng)內(nèi)科疑難病，其患病率僅次于腦卒中疾病，是一種發(fā)作突然且短暫，反復(fù)發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的腦部疾病[1-2]。迄今為止，隨著對(duì)癲癇的不斷深入研究，普遍認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞凋亡及線粒體損傷功能異常等密切相關(guān)[3]。Caspase-3即為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶，活化的Caspase-3更為各種凋亡通路的共同中介，并與線粒體關(guān)系密切。癲癇發(fā)作可引起線粒體Ca2+超載，使Cyt C由線粒體膜間隙釋放入胞漿并與Apal-1結(jié)合，Apal-1通過其Caspase結(jié)構(gòu)域激活Caspase-9進(jìn)而激活其下游的Caspase-3，引起核染色質(zhì)凝聚，DNA斷裂，終使海馬神經(jīng)元凋亡[4-5]。Bcl-2則為抗凋亡的代表，其可調(diào)控線粒體通透性而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，亦可對(duì)Caspase-3的活化起到抑制作用[6]。本研究即通過天麻素穴位注射療法對(duì)戊四氮致癇大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)海馬區(qū)凋亡調(diào)控因子Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)影響進(jìn)行觀察，進(jìn)一步證實(shí)天麻素穴注法干預(yù)治療癲癇模型大鼠療效肯定，為臨床癲癇的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性Wistar大鼠120只，SPF級(jí)，體質(zhì)量：250～325 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在其尾部標(biāo)記編號(hào)，并按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(N組)、模型組(M組)、穴注組(AI組)及西藥組(SV組)，每組各30只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及配置

天麻素(昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：H20013046，0.2 g/支)，充分溶解于150 mL 0.9%氯化鈉溶液中(濃度：2 mg/mL)，按人與大鼠等效劑量比例換算，用量為0.37 mL/kg；丙戊酸鈉緩釋片(山東仁和堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H19983059，0.2 g/片)，加入羧甲基纖維素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn))中充分溶解，配成混懸灌胃液(濃度為20 mg/mL)，4℃遮光保存；戊四氮(PTZ,美國Sigma公司,貨號(hào)：Sigma-P6500)，于每次實(shí)驗(yàn)前30 min，取PTZ晶體300 mg，充分溶解于150 mL 0.9%氯化鈉溶液配置成PTZ溶液(濃度為2 mg/mL)；10%水合氯醛(購自天津市大茂化學(xué)試劑廠)；SABC試劑盒、RT-PCR試劑盒、Western Blot試劑盒、Bcl-2及Caspase-3抗體(上海瑞齊生物科技有限公司)；2 mL無菌注射器(上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司，國械注準(zhǔn)20153152150)。

1.3 模型制備

M、AI、SV組實(shí)驗(yàn)大鼠于每日上午8：30—11：30間給予腹腔注射PTZ溶液35 mg/kg，N組每天給予等劑量0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)注射28天以點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠動(dòng)物模型。于每次注射后，觀察1 h大鼠的行為變化，而后進(jìn)行癇性發(fā)作評(píng)價(jià)，根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)大鼠的癇性發(fā)作情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，并記錄每只大鼠的癇性發(fā)作等級(jí)，對(duì)可能發(fā)生的意外情況進(jìn)行干預(yù)，如出現(xiàn)3 min及以上的V級(jí)發(fā)作時(shí)，立即以10%水合氯醛腹腔注射以終止其癇性發(fā)作，防止死亡。造模周期內(nèi)，連續(xù)5天出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上的癇性發(fā)作，視為造模成功，期間對(duì)于不符合模型或死亡者應(yīng)剔除并補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)目大鼠保證樣本數(shù)量恒定。

1.4 干預(yù)方法

N組在造模期間給予等時(shí)間、等劑量0.9% 氯化鈉溶液腹腔注射，連續(xù)28天。模型組按上述造模方法給予處置。AI組在造模成功后，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]及華興邦制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物圖譜》[9]所述方法，選定實(shí)驗(yàn)大鼠腧穴百會(huì)及大椎，并給予標(biāo)記,給藥時(shí)按照0.37 mL/kg的給藥劑量將配置好的天麻素溶液均等的注射于上述穴位，注射時(shí)百會(huì)穴采取平刺0.1 cm進(jìn)行注射，大椎穴采取直刺0.5 cm進(jìn)行注射，隔日1次，連續(xù)28天。SV組于造模成功后，連續(xù)給予配置好的丙戊酸鈉溶液(350 mg/kg)灌胃28天，日1次。

1.5 標(biāo)本取材與檢測

用10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后，常規(guī)剪毛、消毒、開胸、灌注、斷頭，迅速分離海馬及腦組織，將1 mm3大小組織塊置于2.5%戊二醛固定液中前固定，4℃保存24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，并按試劑盒操作說明書以SABC法檢測Bcl-2、Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)，RT-PCR法檢測Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)，Western Blot法檢測Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析及顯著性檢驗(yàn)。若方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后再重復(fù)以上分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果

在PTZ造模開始后，模型組大鼠活動(dòng)較前活躍，進(jìn)食水明顯增多，持續(xù)約1 h后趨于平靜。模型點(diǎn)燃1周后逐漸出現(xiàn)面部及耳部抽搐、流涎、單側(cè)或雙側(cè)前肢抽搐、身體直立甚至互相撕咬，上述癥狀隨點(diǎn)燃次數(shù)的增加而逐漸加重，以Ⅰ～Ⅳ級(jí)多見；連續(xù)注射戊四氮4周后部分癲癇模型大鼠出現(xiàn)Ⅴ級(jí)癇性發(fā)作。而丙戊酸鈉組及穴位注射組模型大鼠在藥物干預(yù)28天后癇性發(fā)作次數(shù)明顯減少，且發(fā)作級(jí)別顯著下降，以Ⅰ～Ⅱ級(jí)為主。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與N組相比較，M、AI及SV組抗凋亡因子Bcl-2在陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達(dá)均升高，差異顯著(P<0.05)；與M組相比，AI及SV組抗凋亡因子Bcl-2在陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達(dá)升高更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而AI組與SV組相比較，抗凋亡因子Bcl-2在陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達(dá)未見顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1～2。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)

注：與N組比較，△P<0.05；與M組比較，*P<0.05；與AI組比較，▲P>0.05。

圖1 各組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白的表達(dá)

圖2 各組Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)Caspase-3表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與N組比較，M、AI及SV組凋亡因子Caspase-3在陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比，AI 及SV組凋亡因子Caspase-3在陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而AI組與SV組相比較，凋亡因子Caspase-3在陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達(dá)未見顯著差異(P>0.05)。見表2、圖3～4。

3 討論

調(diào)查結(jié)果表明，癲癇作為一種發(fā)作性疾病，在青少年中活動(dòng)性癲癇的發(fā)作率為8%，而中國西部癲癇持續(xù)狀態(tài)所引發(fā)的死亡率為15.9%，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[10]。因此，對(duì)癲癇的治療已然得到當(dāng)今社會(huì)的強(qiáng)烈關(guān)注。在治療方面，西醫(yī)多采用口服藥物及手術(shù)的方式，且以口服藥物治療為主，并取得較好療效。但在控制癲癇發(fā)生的同時(shí)，口服藥物治療亦伴有肝腎損傷、認(rèn)知障礙、內(nèi)分泌紊亂、電解質(zhì)紊亂及共濟(jì)失調(diào)等不良反應(yīng)，且長時(shí)間應(yīng)用口服藥物亦伴有依從性差的發(fā)生，而手術(shù)治療的成功率較低，故現(xiàn)急迫需要探究一種安全有效、無不良反應(yīng)的治療方式。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)Caspase-3表達(dá)

注：與N組比，△P<0.05；與M組比較，*P<0.05；與AI組比較，▲P>0.05。

圖3 各組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白的表達(dá)

圖4 各組Caspase-3蛋白表達(dá)

中醫(yī)學(xué)將癲癇稱之為“癇證”“巔疾”?！鹅`樞》言：“頭重癇……四肢之脈皆脹而縱”，首次記載了癲癇發(fā)病時(shí)肢體痙攣的相關(guān)癥狀，臨床多表現(xiàn)為昏不知人、瘛疚抽掣、甚或角弓反張、口吐涎沫等。《丹溪心法》記載：“非無痰涎壅塞，迷悶孔竅”，指出“痰”為癇證發(fā)病的根本病因。同時(shí)《難經(jīng)》有言：“重陰者癲，重陽者狂”，且《醫(yī)述·癲狂癇》亦記載：“天地一陰陽也，陰陽和則天清地凝，一有偏性，遂有非常之變?！敝赋鲫庩柡蛣t神清志寧，故在治“痰”的同時(shí)，調(diào)其陰陽，不使其有所偏勝，則郁逆得消，神氣復(fù)常。天麻素為中藥天麻塊莖提取物，據(jù)《本草匯言》記載：“天麻...癲癇強(qiáng)痙，四肢攣急”，具有熄風(fēng)止痙、祛風(fēng)通絡(luò)的作用。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究表明，天麻具有較好的鎮(zhèn)靜安眠、鎮(zhèn)痛、增加椎基底動(dòng)脈及小腦下動(dòng)脈等部位血流量、抗驚厥以及抗癲癇的作用[11]。而天麻素作為天麻的有效成分之一，亦有研究指出其可對(duì)抗陣攣性驚厥，具有減輕神經(jīng)元的損傷并抑制其凋亡的作用，可降低癲癇模型大鼠發(fā)作等級(jí)[12-13]。

穴位注射又名“水針”，是由傳統(tǒng)中醫(yī)針灸療法發(fā)展而來，將現(xiàn)代提純藥物結(jié)合針刺手段輸注于相應(yīng)穴位、經(jīng)絡(luò)，進(jìn)而取得更為顯著的療效。本實(shí)驗(yàn)即選用天麻素輸注于患者百會(huì)穴及大椎穴，以此療法抑制癲癇模型大鼠癇性發(fā)作，效果顯著。百會(huì)穴首見于《針灸甲乙經(jīng)》，其位居巔頂之中，為五臟六腑奇經(jīng)三陽百脈會(huì)聚之所。而頭為諸陽之會(huì)，百脈之宗，故百會(huì)穴能通達(dá)陰陽脈絡(luò)，聯(lián)系周身經(jīng)絡(luò)，具有祛痰熄風(fēng)、醒神開竅，止痙的作用。大椎穴又名百勞穴，首見于《素問·氣府》篇，為三陽督脈之會(huì)，通諸陽。而督脈入腦絡(luò)心，故大椎穴能調(diào)節(jié)陰陽平衡，疏通周身經(jīng)絡(luò)，具有醒腦開竅、鎮(zhèn)痙熄風(fēng)的作用。同時(shí)百會(huì)穴與大椎穴均位于體表，取穴方便，操作簡單，故本實(shí)驗(yàn)選用天麻素穴注此二穴，以期達(dá)到醒腦開竅、祛痰熄風(fēng)止痙的功效。

而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,癲癇的發(fā)作與細(xì)胞凋亡及線粒體損傷功能異常有關(guān)。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，癲癇發(fā)作尤其在癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)，常有大量海馬神經(jīng)細(xì)胞受損進(jìn)而引起其凋亡，而凋亡的發(fā)生又進(jìn)一步加重了海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷，并導(dǎo)致與凋亡相關(guān)的因子表達(dá)亦發(fā)生變化[14-16]，其中Caspase-3作為促凋亡因子以及Bcl-2作為抗凋亡因子，均在癲癇的發(fā)作過程中發(fā)揮了重要的作用。Caspase家族所產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)被稱為細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，而Caspase-3為其下游最重要的終末剪切酶，在級(jí)聯(lián)切割途徑中處于核心位置[17-18]。研究表明，癲癇所致的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中， 活化的Caspase-3發(fā)揮著重要的作用[19-22]。Bcl-2作為Bcl-2蛋白家族中抗凋亡成員，起著維持細(xì)胞凋亡-抗凋亡平衡的作用[23]，同時(shí)Bcl-2具有抑制線粒體中內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶及細(xì)胞色素C釋放的作用，進(jìn)而可干預(yù)Caspase-3活化并發(fā)揮抗凋亡的作用，并認(rèn)為其可能對(duì)Caspase-3的合成亦起到一定抑制作用[24-25]。故本實(shí)驗(yàn)通過天麻素穴注的方式干預(yù)Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)以明確其調(diào)控癲癇發(fā)作的作用機(jī)制，以期為癲癇的治療提供新的方向。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用天麻素穴注百會(huì)及大椎穴干預(yù)戊四氮致癇模型大鼠，可有效減少模型大鼠癇性發(fā)作的次數(shù)，并降低癇性發(fā)作的等級(jí)。同時(shí)天麻素穴注百會(huì)及大椎穴亦可有效提高模型大鼠Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白的表達(dá)，并降低Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白的表達(dá)，與模型組比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明天麻素穴注對(duì)癲癇模型大鼠癇性發(fā)作具有較好的抑制作用。而天麻素穴注組與丙戊酸鈉組模型大鼠海馬區(qū)Bcl-2、Caspase-3的陽性細(xì)胞數(shù)、基因及蛋白表達(dá)相比較無明顯差異(P>0.05)，說明天麻素穴注與丙戊酸鈉灌胃治療對(duì)癲癇模型大鼠的治療效果相當(dāng)。綜上所述，天麻素穴注可有效抑制癇性發(fā)作，并調(diào)控抗凋亡因子Bcl-2及凋亡因子Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。因此，天麻素穴注治療癲癇值得臨床進(jìn)一步研究與推廣。