萹蓄草提取物的抗氧化和抑菌活性研究

鄭澤生，楊愛(ài)梅，張富祿，尚暉嵐，李瓊

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省高校中藏藥篩選評(píng)價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

萹蓄(PolygonumaviculareL.)為蓼科Polygonaceae蓼屬一年生草本植物,又名扁竹、竹節(jié)草、烏蓼、地蓼等,分布于全國(guó)大部分地區(qū)[1]。萹蓄中含有多種化學(xué)成分如黃酮類、酚酸類、苯丙素類、糖類、氨基酸以及多種常量和微量元素等[2]。臨床多用于治療泌尿系統(tǒng)感染、細(xì)菌性痢疾、非胰島素依賴性糖尿病、腎炎、結(jié)石、牙痛等疾病[3-4]。民間廣泛用其治療泌尿系統(tǒng)的感染，結(jié)石及腎炎等疾病[5]。

萹蓄的獨(dú)特療效及作為長(zhǎng)期用藥的基礎(chǔ)，深受研究者的重視，然而研究者多以萹蓄化學(xué)成分報(bào)道較多，其藥理活性報(bào)道較少。為了深入研究萹蓄草抗氧化和抑菌活性成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)萹蓄草四種不同溶劑萃取物抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行了研究，以期為萹蓄相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，為萹蓄的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萹蓄藥材于2016年9月購(gòu)于定西市藥材市場(chǎng)，經(jīng)楊林副教授鑒定為P. aviculare的地上部分。五種受試細(xì)菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniau)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)等保藏于蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院中藏藥提取分離技術(shù)研究室。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 均為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；DPPH(Sigma公司)；維生素 C(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)；三氯化鐵﹑鐵氰化鉀 (TCA)；磷酸二氫鉀﹑水楊酸﹑過(guò)氧化氫(天津百世化工有限公司)；牛肉膏(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；蛋白胨﹑瓊脂粉(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；青霉素和鏈霉素 (四川省環(huán)亞生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萹蓄不同溶劑萃取物的制備

粉碎干燥的萹蓄草，樣品用95%乙醇按料液比1∶7(w/v)回流提取，濾渣再用1∶5(w/v)的95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并3次提取液，抽濾，減壓濃縮得乙醇總浸膏。留樣乙醇總浸膏后，將剩余樣品用一定量的蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁萃取，獲得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。

1.2.2 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

(1)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)Shimada等[6]的方法測(cè)定萹蓄提取物的DPPH清除能力，并進(jìn)行了一些修改。將1.2.1項(xiàng)下提取和萃取得到的樣品，依次配置濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg/mL的樣品溶液，取樣品溶液各2.0 mL和2.0 mL現(xiàn)配好的0.05 mg/mL的DPPH乙醇溶液混合，25℃，避光靜置30 min于517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；各樣品溶液2.0 mL依次加入無(wú)水乙醇2.0 mL作為對(duì)照，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2；以無(wú)水乙醇作為空白，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0，VC(抗壞血酸)作為陽(yáng)性對(duì)照，3次平行重復(fù)測(cè)定。清除率按下式計(jì)算：

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)羥基自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)李培源等[7]的方法測(cè)定萹蓄提取物的羥基自由基清除能力，并進(jìn)行了一些修改。將1.2.1項(xiàng)下提取和萃取得到的樣品，依次配制濃度為0.4，0.6，1.0，1.4，1.8，2.2，2.6 mg/mL，得樣品溶液，取各樣品溶液2 mL同1 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液﹑1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液﹑1 mL 0.1% H2O2溶液，并依次定容至10 mL，充分混勻，在37℃保溫30 min于510 nm下測(cè)定吸光度A1；1 mL蒸餾水代替1 mL 0.1% H2O2溶液作為對(duì)照，測(cè)定吸光度A2；2 mL無(wú)水乙醇代替樣品溶液作為空白，測(cè)定吸光度A0，VC(抗壞血酸)作為陽(yáng)性對(duì)照，3次平行重復(fù)測(cè)定。清除率按下式計(jì)算：

·OH清除率(%)= [1-(A1- A2)/A0]×100%

(3)總還原力的測(cè)定

根據(jù)張國(guó)廣等[8]的方法測(cè)定萹蓄提取物的總還原力，并進(jìn)行了一些修改。將1.2.1項(xiàng)下提取和萃取得到的樣品，依次配制濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0,1.2 mg/mL，得樣品溶液，取各樣品溶液2.5 mL同0.2 mol/L pH=6.6的磷酸緩沖液2.5 mL﹑ 1%鐵氰化鉀2.5 mL，充分混勻，在50℃水浴中反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后4 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，分別加入蒸餾水4 mL﹑0.1%三氯化鐵1 mL，混勻后靜置10 min，在700 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)。VC(抗壞血酸)作為陽(yáng)性對(duì)照，3次平行重復(fù)測(cè)定。吸光度值越大，表明還原能力越強(qiáng)。

1.2.3 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌﹑金黃色葡萄球菌﹑肺炎鏈球菌﹑地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌為受試菌，采用牛津杯法[9-10]對(duì)萹蓄草乙醇總浸膏，石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。取200 μL菌液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板上，將已滅菌牛津杯淺淺插入已經(jīng)涂布的培養(yǎng)基表面，每個(gè)平板置3個(gè)牛津杯，用移液槍吸取不同濃度的樣品200 μL于牛津杯內(nèi)，并對(duì)不同濃度的平板進(jìn)行標(biāo)注。以二甲基亞砜(DMSO)作為空白對(duì)照，青霉素和鏈霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。將各樣液平板放置于37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，觀察并測(cè)量抑菌圈的大小，并計(jì)算測(cè)量數(shù)據(jù)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化活性的測(cè)定

(1)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

如圖1所示為萹蓄草不同溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率。四種萃取物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨樣品質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，并呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，通過(guò)回歸方程計(jì)算得出四種萃取物的半清除率EC50見(jiàn)表1。其中乙酸乙酯萃取物半清除率最小，說(shuō)明其對(duì)DPPH自由基清除效果比較理想，但清除作用小于抗氧化劑Vc。

圖1 萹蓄草不同溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率

提取物乙醇總浸膏石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物EC50/mg·mL-16.8747.9935.9328.972

(2)羥基自由基清除能力的測(cè)定

結(jié)果如圖2所示為萹蓄草不同溶劑萃取物對(duì)羥基自由基的清除率，四種不同溶劑萃取物對(duì)羥自由基的清除率在一定范圍內(nèi)與濃度呈線性正相關(guān)，繪出相應(yīng)曲線，計(jì)算EC50，結(jié)果見(jiàn)表2。其中，乙酸乙酯萃取物對(duì)羥基自由基的EC50為4.831 mg/mL，表明有較好的抗氧化活性。

圖2 萹蓄草不同溶劑萃取物對(duì)羥基自由基的清除率

提取物乙醇總浸膏石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物EC50/mg·mL-16.9357.9934.8316.836

(3)總還原力的測(cè)定

如圖3所示為萹蓄草不同溶劑萃取物總還原力的測(cè)定，四種萃取物均具有一定的還原能力。在測(cè)量范圍內(nèi)，當(dāng)樣品濃度大于0.8 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯萃取物比其他溶劑萃取物的還原能力要好很多，當(dāng)樣品濃度大于1 mg/mL時(shí)，乙醇總浸膏和正丁醇萃取物的還原能力接近?？傔€原力的排序依次是：Vc>乙酸乙酯萃取物 >石油醚萃取物>正丁醇萃取物>乙醇總浸膏。

圖3 萹蓄草不同溶劑萃取物總還原力的測(cè)定

2.2 最低抑菌濃度的測(cè)定

如表3所示為萹蓄草不同溶劑萃取物的最低抑菌濃度。四種萃取物在較低濃度下均有抑菌作用，乙酸乙酯萃取物對(duì)五種受試菌抑菌的MIC值為1 mg/mL，表明乙酸乙酯萃取物抑菌作用較強(qiáng)，而乙醇總浸膏﹑石油醚萃取物﹑正丁醇萃取物對(duì)肺炎鏈球菌﹑金黃色葡萄球菌﹑地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC值為3 mg/mL?？梢缘贸鲆宜嵋阴ゲ课粸槿q蓄草提取物的最佳抑菌部位。

表3 萹蓄草不同溶劑萃取物的最低抑菌濃度(mg/mL)

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 萹蓄95%乙醇提取物，石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物都具有清除DPPH自由基活性，清除羥基自由基活性和還原能力。然而，與陽(yáng)性對(duì)照藥維生素C相比，活性較低。四種萃取物對(duì)大腸桿菌﹑金黃色葡萄球菌﹑肺炎鏈球菌﹑地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌均具有較好的抑制活性。萹蓄乙酸乙酯萃取物的抗氧化和抑菌活性都較好，是具有多種藥理活性的天然產(chǎn)物，其提取物是新藥物開(kāi)發(fā)的優(yōu)良材料。本研究結(jié)果為萹蓄資源的拓展利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑和抑菌劑具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景，為我國(guó)豐富的中草藥開(kāi)發(fā)具有重要意義。