血清淀粉樣蛋白A對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其在胃癌早期診斷中的應(yīng)用

諶秋華，陳燕玲，郭 健

0 引 言

胃癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和病死率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的健康［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年我國(guó)胃癌發(fā)病率為31.28/10萬，病死率為22.04/10 萬，分別占全球第5 和第6 位［2-3］。胃癌多無明顯的特異性臨床表現(xiàn)，且預(yù)后效果差。因此，尋找胃癌血清特異性標(biāo)志物具有重要的意義。

血清淀粉樣蛋白A1（serum amyloid A protein 1，SAA1）是一種主要的急性期蛋白，在炎癥反應(yīng)、組織損傷和慢性炎性疾病中存在高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，SAA1 在胃癌、肺癌等其他惡性腫瘤中表達(dá)升高，可能是腫瘤的潛在標(biāo)志物［4-6］。本研究采用ELISA 方法檢測(cè)胃癌患者及健康體檢者血清中SAA1 的表達(dá)水平，分析其與臨床病理因素的相關(guān)性。通過人工干擾胃癌細(xì)胞中SAA1 表達(dá)，檢測(cè)胃癌細(xì)胞侵襲能力變化，探討胃癌患者SAA1 的表達(dá)及在胃癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象人胃癌SGC-7901 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。收集2017 年9 月至2018 年12 月于我院就診并確診的82 例胃癌患者，其中男59 例、女性23 例，年齡31～68 歲，平均（49.75±11.47）歲。以國(guó)際抗癌聯(lián)盟及美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)頒布的第7 版胃癌TNM 分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ期15 例、Ⅱ期21 例、Ⅲ期26 例、Ⅳ期20 例。本組患者術(shù)前均未接受任何手術(shù)、放療、化療治療。另選擇30 例同時(shí)期于我院健康體檢，并排除其他消化系統(tǒng)疾病的健康人血清作為對(duì)照組。其中男18 例、女12 例，年齡25～78 歲，平均（49.23±12.23）歲。2 組研究對(duì)象性別、年齡等基線資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要儀器及試劑胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，GAPDH、SAA1抗體購(gòu)自英國(guó)ABCam，BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)millipore公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher，人SAA1 ELISA 檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)KHA0011）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，iMark 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將人胃癌SGC-7901 細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶約80%后按1∶4傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。空白對(duì)照組僅添加轉(zhuǎn)染試劑；實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染SAA1-siRNA 和NC-siRNA。轉(zhuǎn)染步驟參考Invitrogen 公司提供的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 方法進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染完成6 h 后更換為完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot 檢測(cè)SAA蛋白表達(dá)情況，以GAPDH為參照。

1.4 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞活力將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種到96孔板，每孔接種1×106個(gè)；另取未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為正常對(duì)照組，每組重復(fù)6 次，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h 后每孔加入CCK8 10μL，37 ℃反應(yīng)2 h，酶標(biāo)檢測(cè)450 nm 吸收度。細(xì)胞活力=（各組A450/正常細(xì)胞A450）×100%。

1.5 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞侵襲Transwell 侵襲小室鋪Matrigel 膠，取轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×106個(gè)/ml 細(xì)胞，用無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸，取100μL（1×105個(gè)）細(xì)胞懸液，加入Transwell 小室上室，在下室加入600μL 完全培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)48 h，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗滌1 次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 再次洗滌1次，檢測(cè)細(xì)胞是否穿過小孔，如有穿過終止其他實(shí)驗(yàn)組，并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.6 ELISA 法檢測(cè)血清SAA1 含量抽取患者清晨空腹靜脈血5 mL，室溫放置30 min，4 ℃下以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min（離心半徑15 cm），分離血清，分裝保存于-80℃冰箱。采用雙抗體夾心ELISA 法檢測(cè)SAA1 表達(dá)含量。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，并根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)SAA1 進(jìn)行定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析。血清SAA1 濃度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組變量間比較采用單因素方差分析法，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用Spearman 法分析SAA1與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性；繪制ROC 曲線評(píng)價(jià)SAA1 的敏感性和特異性。以P≤0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western Blot 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SAA1 表達(dá)量單因素方差分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SAA1-siRNA 組SAA1 表達(dá)量顯著低于其他處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.069，P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染成功，顯著抑制SAA1 基因表達(dá)。NC-siRNA 組與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.345），見圖1。

2.2 CCK8 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAA-siRNA 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力顯著低于其他處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.290，P＜0.01），表明降低SAA1 表達(dá)量顯著影響細(xì)胞活力。NC-siRNA組與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.093）。見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組SAA1蛋白表達(dá)情況Figure 1 The expression of SAA1 in different groups

圖2 SAA1對(duì)各組細(xì)胞活力的影響Figure 2 Effect of SAA1 on cell viability of each group

2.3 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力Transwell 小室侵襲檢測(cè)結(jié)果表明，靶向下調(diào)SAA-siRNA 后細(xì)胞侵襲能力較其他處理組顯著下降（F=45.946，P＜0.01）。NC-siRNA組與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.22）。見圖3。

圖3 SAA1對(duì)各組細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 3 Effect of SAA1 on the invasive ability of cells in each group of cells

2.4 血清中SAA1 表達(dá)水平比較ELISA 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組胃癌患者血清中SAA1 水平［（50.03±20.89）μg/mL］顯著高于對(duì)照組［（24.06±10.72）μg/mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ROC 曲線顯示，SAA1 診 斷 胃 癌 的AUC 為0.791（95%CI：0.701～0.880），檢測(cè)閾值為31.97μg/mL，其診斷敏感性和特異性分別為0.659和0.833。見圖4。

圖4 SAA1表達(dá)水平診斷胃癌的ROC曲線Figure 4 ROC curve of SAA1 expression level in diagonosis of gastric cancer

2.5 SAA1表達(dá)水平與臨床病理因數(shù)的相關(guān)性血清SAA1 的表達(dá)水平與胃癌患者性別、年齡、腫瘤的轉(zhuǎn)移情況無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；與腫瘤最大徑和侵襲程度具有相關(guān)性，且隨著腫瘤侵襲程度的增加而增加（P＜0.05），見圖5，表1。

圖5 血清SAA1與腫瘤最大徑相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Figure 5 Correlation analysis between serum SAA1 and tumor maximum diameter

表1 胃癌患者血清SAA1表達(dá)水平與臨床病理因數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果（）Table 1 Correlation between SAA1 expression level and clinicopathological factors in patients with gastric cancer（）

表1 胃癌患者血清SAA1表達(dá)水平與臨床病理因數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果（）Table 1 Correlation between SAA1 expression level and clinicopathological factors in patients with gastric cancer（）

項(xiàng)目n SAA1（μg/mL）r值P值年齡-0.744＜52歲4249.07±19.23≥52歲4051.23±22.71性別-0.327男 5954.28±18.81女2348.89±21.69侵襲程度0.409＜0.001 T1-T23643.86±19.95 T3-T44654.86±20.54腫瘤最大徑0.2280.012＜6 cm4844.65±16.17≥6 cm3457.61±24.44淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-0.368無 3952.48±13.17有4351.52±18.77遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移-0.249無 7151.75±15.51有1152.68±20.13

3 討 論

我國(guó)胃癌患者5 年生存率遠(yuǎn)低于韓國(guó)、日本等國(guó)家，其主要原因與胃癌早期篩查檢出率不足有關(guān)，多數(shù)患者一經(jīng)查出即為癌癥晚期，進(jìn)行有效篩查對(duì)延長(zhǎng)癌癥患者生存期，提高生活質(zhì)量顯得尤為重要［7］。目前胃癌早期篩查以胃鏡病理檢測(cè)為主，腫瘤標(biāo)志物為輔（如CEA、CA199、CA724 等），對(duì)于胃癌早期診斷相對(duì)價(jià)值偏低［8-9］。

SAA 是一類由多基因編碼的多形態(tài)蛋白家族，組織淀粉樣蛋白A 的前體物質(zhì)，屬于急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其含量在疾病急性期會(huì)迅速升高，疾病恢復(fù)期迅速下降。大量研究表明，SAA 表達(dá)與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展顯著相關(guān)，在肺癌［10］、食管癌［11］、卵巢癌［12］等患者血清中均發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的SAA。SAA根據(jù)表達(dá)情況不同可分為急性型和組成型，其中人類基因組中編碼急性期的基因有Saa1和Saa2。SAA1是人類中由Saa1 基因編碼的蛋白質(zhì)［13-14］。SAA1 是一種主要的急性期蛋白，主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，以應(yīng)對(duì)感染，組織損傷和惡性腫瘤［15］。當(dāng)釋放到血液循環(huán)中時(shí)，SAA1 作為與高密度脂蛋白相關(guān)的載脂蛋白存在［16］。SAA1 是淀粉樣蛋白A（AA）的主要前體，其沉積物導(dǎo)致炎性淀粉樣變性［17-18］。SAA1 參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。當(dāng)炎癥、損傷等激發(fā)時(shí)，IL-1、IL-6 等促炎因子調(diào)控肝臟分泌大量SAA1［18］。有研究通過高效液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌患者SAA1 表達(dá)水平顯著升高，且與腫瘤的侵襲程度相關(guān)，提示SAA1 可能是胃癌的潛在生物標(biāo)志物［19］。Chan 等［4］研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者中SAA 的表達(dá)含量與腫瘤分期、位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且高濃度SAA 患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加近4 倍，提示SAA 對(duì)胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)，可作為有價(jià)值的術(shù)后隨訪工具。

本研究通過轉(zhuǎn)染SAA1-siRNA 至胃癌細(xì)胞中，經(jīng)Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SAA1 表達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染SAA1-siRNA 組細(xì)胞SAA1 表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)染NC-siRNA 組以及空白對(duì)照組，證明轉(zhuǎn)染效果較好，可有效降低SAA1 表達(dá)量；細(xì)胞活力檢測(cè)以及細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)結(jié)果表明，下調(diào)SAA1 表達(dá)可有效降低胃癌細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞侵襲能力。此外，臨床標(biāo)本檢測(cè)表明胃癌患者血清SAA1 表達(dá)水平顯著高于健康體檢者，研究結(jié)果與Subbannayya 等［21］一致。與此同時(shí)，本研究采用ROC 特征曲線分析SAA1 診 斷 胃 癌 的AUC 為0.791（95%CI：0.701～0.880），檢測(cè)閾值為31.97μg/mL，其診斷敏感性和特異性分別為65.9%和83.3%。通過進(jìn)一步對(duì)SAA1 與胃癌臨床病理因素相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SAA1表達(dá)含量與胃癌大小和臨床分析呈正相關(guān)，提示血清SAA1 可作為監(jiān)測(cè)胃癌病情進(jìn)展的指標(biāo)之一，同過表達(dá)SAA1 可能促進(jìn)胃癌的增殖和侵襲。由此推斷，SAA1 可能作為新潛在的胃癌血清標(biāo)志物之一，而且檢測(cè)血清SAA1 具有操作簡(jiǎn)捷、價(jià)格低廉、動(dòng)態(tài)檢測(cè)、非侵入性等特點(diǎn)，是臨床檢測(cè)的高價(jià)值血清標(biāo)志物之一。本研究中，SAA1 的靈敏度僅為65.9%，其原因可能是臨床樣本量較小，血清SAA1水平差異較大，需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)調(diào)查中增加大的樣本數(shù)量，以減少差異。SAA1 并非是胃癌特異性標(biāo)志物，在臨床早期診斷、診治中仍需結(jié)合其他的腫瘤標(biāo)志物和臨床病理資料以提高胃癌診斷的靈敏度和特異性。

綜上所述，SAA1 可有效影響胃癌細(xì)胞活力及侵襲能力，抑制SAA1 的表達(dá)可能會(huì)抑制胃癌病程。SAA1 與臨床病癥分析表明，在胃癌患者中高表達(dá)的SAA1 可作為新型胃癌標(biāo)志物，但仍需更多的血清樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，以確定SAA1 在胃癌診斷中的價(jià)值以及其與胃癌的預(yù)后關(guān)系和其對(duì)胃癌的作用機(jī)制。