七帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT—LAMP檢測(cè)方法

劉濱++劉新富++曾霖++孟振++劉江春

摘 要：報(bào)道了一種可以快速、靈敏地檢測(cè)七帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒（NNV）的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（RT-LAMP）。該方法參考赤點(diǎn)石斑魚(yú)NNV病毒的主衣殼蛋白（MCP）基因的保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物克隆出七帶石斑魚(yú)NNV的基因序列，利用Primer Explorer V4 軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)針對(duì)所克隆NNV基因序列的特異性引物，建立了RT-LAMP的反應(yīng)體系，并分別對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)的引物濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，形成了七帶石斑魚(yú)NNV病毒RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)。實(shí)踐應(yīng)用結(jié)果表明，在63 ℃的最佳反應(yīng)溫度下，采用RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)經(jīng)過(guò)45 min就能完成一次檢測(cè)，準(zhǔn)確率達(dá)到100 %。本研究建立的RT-LAMP檢測(cè)NNV技術(shù)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，為七帶石斑魚(yú)等石斑魚(yú)無(wú)NNV受精卵和仔稚魚(yú)的生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和篩選提供了一種方便、靈敏的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：七帶石斑魚(yú)；神經(jīng)壞死病毒；檢測(cè)；RT-LAMP

中圖分類號(hào)：S941 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.07.006

Abstract：A rapid and sensitive technique for detecting of Nervous Necrosis Virus in seven-band grouper was developedthrough reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP） method. A set of six specific primers were designed based on MCP gene of Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus （ RGNNV） using Primer Explorer V3 software. The parameters of primer concentration， reaction time and temperature were optimized.The RT-LAMP method established in this article was applied to detect nervous necrosis virus of seven-band grouper larvae in the fish farming field， the results showed that the sensitivity of RT-LAMP method was consistent with the nested RT-PCR method， as well as the detection result of RT-LAMP method could be easily determinate，andthe detection time was short， which can be completed within 2 hours. The RT-LAMP assay developed in this article wasvery suitable for rapid diagnosis of early NNV infection of seven-band grouper larvae in fish farming field.

Key words： seven-band grouper （Epinephelus septemfasciatus）； nervous necrosis virus （ NNV）； detection； reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）

七帶石斑魚(yú)（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我國(guó)沿海分布緯度最高的石斑魚(yú)種類，除了具有個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)外，對(duì)低溫的耐受能力較強(qiáng)，生存水溫9～34 ℃，攝食水溫12～32 ℃，有“冷水石斑”之稱，被認(rèn)為是東北亞溫帶海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖理想海水魚(yú)類品種之一[1]，其苗種繁育技術(shù)的突破，可以緩解我國(guó)東海北部和黃渤海沿岸網(wǎng)箱適養(yǎng)魚(yú)類品種缺乏的問(wèn)題，因此備受業(yè)界重視。但是盡管國(guó)內(nèi)外研究多年，七帶石斑魚(yú)的苗種繁育技術(shù)始終不能穩(wěn)定，在所面臨的技術(shù)瓶頸中，神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）造成的早期苗種死亡率居高不下是目前最亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervousnecrosis，VNN）是造成多種海水魚(yú)類早期發(fā)育階段大量死亡的諾達(dá)病毒科（Nodaviridae）的一種小RNA病毒[2]，對(duì)石斑魚(yú)的危害尤為嚴(yán)重，常常造成90%以上的仔稚魚(yú)死亡。為了明析NNV的傳播途徑和研發(fā)出相應(yīng)的預(yù)防技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了多種NNV檢測(cè)技術(shù)，如原位雜交、免疫組織化學(xué)方法、熒光抗體技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)、ELISA、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)定量PCR等方法[3-7]。目前在生產(chǎn)實(shí)際中較為有效的檢測(cè)手段均建立在神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)之上，但仍然存在操作繁瑣、周期長(zhǎng)、需要專用儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)中快速、敏感、準(zhǔn)確的檢測(cè)需求。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸片段擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)由日本學(xué)者Notomi等于2000 年首先開(kāi)發(fā)，其核心由4條引物（2條外引物和2條內(nèi)引物）和一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）組成，原理是通過(guò)使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)以到達(dá)快速高效擴(kuò)增的目的[8]。LAMP技術(shù)在恒溫（60～65 ℃）條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，可以通過(guò)肉眼可見(jiàn)的白色焦磷酸鎂沉淀或加入染料觀察顏色變化[9]判定結(jié)果。Nagamine K等[10]于2002年通過(guò)在4條引物的基礎(chǔ)上添加了2條環(huán)引物L(fēng)F/LB，能夠明顯加快反應(yīng)速度，提高擴(kuò)增效率。由于LAMP技術(shù)具有反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、成本低、結(jié)果易判定等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被成功用于檢測(cè)魚(yú)類的諸多致病病毒，如彈狀病毒、虹彩病毒、病毒性出血敗血癥病毒和呼腸孤病毒等[11-15]。

本研究在克隆出七帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒（SGNNV）核酸序列的基礎(chǔ)上，建立了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的七帶石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒LAMP檢測(cè)方法，以期為今后在七帶石斑魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、即時(shí)的高效病毒檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 生物材料 2012年于萊州明波水產(chǎn)有限公司采集的8份表現(xiàn)病毒性神經(jīng)壞死癥狀的七帶石斑魚(yú)苗種和2份健康苗種；所有發(fā)病苗種均通過(guò)陳信忠等發(fā)表的RT-PCR方法檢測(cè)確定后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 病毒RNA 取發(fā)病七帶石斑魚(yú)的腎、脾、腦等組織混合勻漿，提取病毒RNA參照TRIzol Reagent（Invitrogen）使用方法，從100 mg組織中提取總RNA，-70 ℃保存?zhèn)溆?；石斑魚(yú)虹彩病毒（SIGV）序列為筆者根據(jù)Genbank中收錄的石斑魚(yú)虹彩病毒（ID：AY621625）進(jìn)行體外合成后于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑與儀器 Bst DNA Polymerase和10×Thermo Pol buffer 購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；Premix Taq、DL2000 DNA marker、dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自臺(tái)灣生工；SYBR Green Ⅰ購(gòu)自廈門百維信公司；甜菜堿（分析純）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；瓊脂糖購(gòu)自臺(tái)灣生工；BIO-RAD MyCycler梯度PCR儀，恒溫金屬浴及冷凍離心機(jī)等儀器均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2. 七帶石斑魚(yú)NNV病毒序列鑒定 根據(jù)Genbank已報(bào)道的赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)性壞死病毒MCP基因序列，進(jìn)行序列比對(duì)后選取最為保守的中間部分設(shè)計(jì)引物NNV-F和NNV-R，引物序列見(jiàn)表1。以提取的2 μL總RNA為模板、NNV-R為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2 μLcDNA為模板、NNV-F和NNV-R為引物，使用Premix Taq進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系終體系25 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，46 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。其余PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后送博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast程序與Genbank中收錄的石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒MCP基因序列進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

1.2.2 LAMP引物設(shè)計(jì) 采用Primer Explorer V4軟件（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）針對(duì)七帶石斑魚(yú)神經(jīng)性壞死病毒MCP基因序列設(shè)計(jì)6條引物，依次為正向內(nèi)引物（FIP）、反向內(nèi)引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向環(huán)引物（LF）及反向環(huán)引物（LB），由博尚生物技術(shù)有限公司合成引物，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3 反應(yīng)體系建立及優(yōu)化 建立的RT-LAMP反應(yīng)體系由2.5 μL10×ThermoPol buffer，1.6 μmol·L-1 FIP、BIP，0.2 μmol·L-1 F3、B3，0.8 μmol·L-1 L F、LB，2 mol·L-1 Betaine、4 μL10 mmol·L-1 dNTP，6 mmol·L-1 MgSO4，0.5 μL 200 U Reverse Transcriptase MMLV（TaKaRa），1 μL 8U Bst DNA聚合酶（New England Biolabs），0.5 μL 40 U Ribonuclease inhibitor（TaKaRa）和2 μL模板組成。為優(yōu)化反應(yīng)溫度，將經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)短離心混勻后的反應(yīng)混合物分別在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃反應(yīng)1 h后，再經(jīng)過(guò)82 ℃10 min終止反應(yīng)。為測(cè)定環(huán)引物對(duì)反應(yīng)時(shí)間的影響，分別采用4條引物（FIP，BIP，F(xiàn)3，B3）和6條引物（FIP，BIP，F(xiàn)3，B3，LF 和LB）的反應(yīng)體系，選擇63 ℃的反應(yīng)溫度，分別反應(yīng)25，35，45，55，60，65，75，85，95 min，再經(jīng)過(guò)82 ℃10 min終止反應(yīng)。隨后對(duì)不同反應(yīng)溫度和不同反應(yīng)時(shí)間下的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳法及熒光染料法檢測(cè)。在凝膠電泳檢測(cè)中，如果出現(xiàn)典型的梯形條帶即表明發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)；在SYBR GREENⅠ熒光染料法檢測(cè)中如果反應(yīng)體系顏色變綠，則說(shuō)明發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)；如果反應(yīng)體系顏色依舊為橙色，則說(shuō)明未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.4 特異性分析 分別取神經(jīng)壞死病毒和虹彩病毒的核酸樣本為模板進(jìn)行LAMP方法檢測(cè)，并以水作為模板設(shè)置空白對(duì)照。分別采用瓊脂糖凝膠電泳法及SYBR GreenⅠ法熒光染料法檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，分析方法的特異性。

1.2.5 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果 在養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)對(duì)10尾待檢的石斑魚(yú)，開(kāi)展了NNV病毒的LAMP方法檢測(cè)，在檢測(cè)過(guò)程中，分別以NNV RNA和水為模板作為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。同時(shí)采用PCR方法與LAMP的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立

2.1.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化LAMP 反應(yīng)在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃均有擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物亮度比較接近，說(shuō)明該反應(yīng)體系中的引物設(shè)計(jì)比較理想，反應(yīng)條件具有比較好的寬容性，能夠保證反應(yīng)體系充分有效擴(kuò)增。在所有的溫度梯度中63 ℃下的產(chǎn)量相對(duì)更高，因此，可確定最優(yōu)的LAMP反應(yīng)溫度為63 ℃，電泳結(jié)果及SYBR GreenⅠ檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 當(dāng)反應(yīng)體系中加入環(huán)引物時(shí)，LAMP反應(yīng)45 min就可觀察到明顯的擴(kuò)增，而在無(wú)環(huán)引物時(shí)，在反應(yīng)時(shí)間到95 min時(shí)仍無(wú)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖2）。表明在反應(yīng)體系中加入環(huán)引物能夠顯著地縮短反應(yīng)時(shí)間。為了保證低濃度的樣本能夠充分反應(yīng)并得到準(zhǔn)確地檢測(cè)，采用了60 min作為本LAMP方法的反應(yīng)時(shí)間。