骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療四氯化碳大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

鄭雪，李靜，黃俊凱，丁新，陳衛(wèi)剛

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，新疆 石河子 832000)

肝病是全球的高發(fā)疾病，根據(jù)《柳葉刀》發(fā)布的2017年GBD(The Global Burden of Diseases,Injuries,and Risk Factors Study 2017)，僅2017年全球由各種原因?qū)е碌穆愿尾?、肝硬化及肝癌發(fā)病人數(shù)為6,108,000[1]。我國的肝病防治形勢也不容樂觀，2017年我國城鎮(zhèn)居民肝疾病死亡率為5.85(1/10萬)，其中肝硬化為5.08(1/10萬)，而農(nóng)村居民居民肝疾病死亡率為5.78(1/10萬)，其中肝硬化4.92(1/10萬)[2]。肝纖維化是多種慢性肝病向終末期肝病發(fā)展的中間環(huán)節(jié)，是各種致病因素導(dǎo)致的肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生，肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)病理性沉積的病理生理過程[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，同種異體移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)能夠有效改善肝纖維化大鼠的肝臟功能，降低肝纖維化程度[4-5]。BMSC是位于骨髓腔內(nèi)的一種間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSC)，具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)特性以及多向分化潛能，且來源豐富、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，是治療肝纖維化的新方法。

國內(nèi)外大量研究證實(shí)MSC能夠有效抑制肝纖維化程度，改善肝臟功能[6-7]。然而有一部分研究表明，BMSC移植后大鼠肝纖維化程度未緩解或緩解程度不顯著。雷香麗等[8]發(fā)現(xiàn)移植BMSC后肝門靜脈區(qū)和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)仍有大量紅染膠原纖維沉積形成假小葉，且BMSC組膠原面積大于陰性對照組。FORBES等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者行骨髓移植后，有一部分BMSC沒有分化為肝細(xì)胞而是轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。由于已有研究中對于BMSC療效的爭議，本實(shí)驗(yàn)擬用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，同種異體移植BMSC后，探討其對肝纖維化的治療情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20) g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2016-0003)，飼養(yǎng)于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心；L-DMEM(Gibco/美國)；胎牛血清(BI/以色列)；CD29-FITC、CD90-PE、CD45-FITC(eBioscience/美國)；四氯化碳(國藥化學(xué)試劑公司/中國)；4%多聚甲醛(Abcam/英國)；RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司/中國)；SYBR? Select Master Mix(Applied Biosystems/美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSC的分離、培養(yǎng)及鑒定

取健康雄性SD大鼠，脫臼處死，于無菌條件下分離大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，暴露骨髓腔，用完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，緩慢吹打沖洗物。取200目細(xì)胞濾網(wǎng)，過濾沖洗物制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。取第3代BMSC，流式細(xì)胞術(shù)測定CD29、CD90、CD45等細(xì)胞表面分子。

1.2.2 SD大鼠肝纖維化模型的建立

取健康雄性SD大鼠20只構(gòu)建肝纖維化模型，另取6只正常大鼠作為空白對照組，每天12 h光照/黑暗交替，自由飲食。將肝纖維化模型大鼠隨機(jī)分為BMCS組、PBS組，每組10只。采取CCl4法建模，建模周期為7周。分別給予 BMSC組、PBS組大鼠背部皮下注射50% CCl4-植物油溶液，劑量為3 mL/kg，每周2次。給予空白對照組大鼠背部皮下注射生理鹽水，劑量為3 mL/kg，每周2次。

1.2.3 細(xì)胞移植

于造模后第8周，取細(xì)胞融合約80%～90%的第3代BMSC，用1×PBS溶液制成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液1 mL，經(jīng)BMSC組大鼠尾靜脈緩慢推注，PBS組經(jīng)尾靜脈推注等體積1×PBS溶液。移植BMSC后，繼續(xù)按3 mL/kg，每周2次注射50%CCL4-植物油溶液維持肝纖維化。

1.2.4 肝臟功能檢測及病理組織學(xué)檢測

移植后第5周，采集大鼠血液及肝臟組織。全自動生化儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(Albumin，Alb)；取大鼠肝臟左葉組織，約1 cm×1cm×0.5 cm，常規(guī)石蠟切片后行HE染色、Masson染色。取Masson染色切片，每個(gè)切片取3個(gè)不重復(fù)視野(×100)，以藍(lán)色膠原沉積為陽性信號，用Image J圖像分析軟件測算CVF。另取部分肝組織(大小約為1 cm×1 cm×1 cm)，于-80 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.5 qRT-PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)

采用Trizol法提取大鼠肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，利用SYBR? Select Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BMSC形態(tài)特征及鑒定

BMSC原代初接種時(shí)，細(xì)胞懸液中可見大量圓形、類圓形細(xì)胞，無明顯特征。接種后48 h首次半量換液去除未貼壁細(xì)胞后，可見少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈圓形、不規(guī)則多邊形及粗短梭形，細(xì)胞核大且核仁明顯，細(xì)胞胞漿豐富，折光性好。原代培養(yǎng)第7天，見貼壁細(xì)胞數(shù)量有小幅增長，增殖速度較慢，貼壁細(xì)胞中不規(guī)則多邊形、粗短梭形數(shù)量增多，細(xì)胞融合至90%以上時(shí)可見細(xì)胞呈旋渦狀排列。BMSC傳代后細(xì)胞增殖速度明顯增快，細(xì)胞呈簇狀分布，多為長梭形、不規(guī)則多邊形，傳代至第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)趨于均一。流式分析結(jié)果顯示，大鼠BMSC檢測細(xì)胞表面分子CD29、CD90的陽性率分別為98.4%、99.6%，CD45的陽性率為：5.3%(圖1)。

a—CD29-FITC：98.4%；b—CD90-PE：99.6%；c—CD45-FITC：5.3%圖1 流式細(xì)胞檢測BMSC表面標(biāo)志物Fig.1 Flow cytometry to detect BMSC surface markers

2.2 BMSC對大鼠肝臟大體表現(xiàn)

空白對照組大鼠：色澤紅潤，表面光滑無結(jié)節(jié)，肝葉邊緣銳利，質(zhì)地柔軟(圖2a)。PBS組大鼠肝臟：較空白對照組大鼠肝臟縮小，顏色晦暗，呈棕褐色，表面彌漫大小不等結(jié)節(jié)，肝葉邊緣變鈍呈波浪形，肝臟質(zhì)地變硬，門靜脈明顯增粗(圖2b)。BMSC組肝臟：肝臟體積較空白對照組大鼠略大，肝葉邊緣變鈍，表面可見少量結(jié)節(jié)分布，質(zhì)地微硬(圖2c)。

a—空白對照組大鼠肝臟大體表現(xiàn)；b—PBS組大鼠肝臟大體表；c—BMSC組大鼠肝臟大體表現(xiàn)圖2 大鼠肝臟大體表現(xiàn)Fig.2 Rat liver performance

2.3 BMSC對大鼠肝功的影響

移植后第5周，全自動生化儀檢測大鼠ALT、AST、Alb。BMSC組大鼠的ALT、AST、Alb與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PBS組與空白對照組比較ALT、AST水平增高，Alb水平降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PBS組與BMSC組比較ALT、AST水平增高，Alb水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、圖3)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組動物肝功指標(biāo)及CVF值

Tab.2 Liver function indicators and CVF values of each experimental group

組別ALT(U/L)AST/(U/L)Alb/(g/L)CVF/%空白對照組40.40±14.0687.40±15.3735.84±3.950.20±0.09PBS組182.40±51.94ab253.20±40.70ab25.84±4.32 ab9.22±6.72 abBMSC組59.25±9.00102.10±11.7633.58±7.374.91±2.05 cF32.44454.4297.46412.666P0.0000.0000.0040.000

注：a與空白對照組比較，P<0.05；b與與BMSC組比較，P<0.05；c與空白對照組比較，P<0.05。

注：*P< 0.05;**P> 0.05。圖3 各組實(shí)驗(yàn)動物肝功指標(biāo)與CVF值的比較Fig.3 Comparison of liver function indicators and CVF value of experimental animals in each group

2.4 BMSC對大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響

移植BMSC第5周時(shí)，取PBS組、BMSC組大鼠肝臟行HE、Masson染色。PBS組：橋接壞死范圍廣，累及多個(gè)小葉，小葉結(jié)構(gòu)失常，出現(xiàn)門脈-中心靜脈架橋樣隔壁性纖維化；部分切片橋接壞死嚴(yán)重，可見假小葉形成，已達(dá)到彌漫性完全性肝硬化(圖4a、c)。BMSC組肝臟切片可見：肝小葉網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞多呈脂肪樣或空泡樣變性小葉周邊炎癥明顯，部分肝小葉內(nèi)可見嗜酸小體；匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤，部分匯管區(qū)出現(xiàn)碎屑樣壞死；有膠原纖維存在，多在門脈區(qū)少量存在(圖4b、d)。取PBS組、BMSC組Masson染色切片。利用Image J軟件測算各組大鼠CVF值，與空白對照組相比，PBS組、BMSC組CVF均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與PBS組相比，BMSC組CVF降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、圖3)。

a—PBS組肝臟組織HE染色；b—BMSC組肝臟組織HE染色；c—PBS組肝臟Masson染色；d—BMSC組肝臟Masson染色(×100)圖4 BMSC組、PBS組HE、Masson染色Fig.4 HE,Masson staining in BMSC group and PBS group

2.5 qRT-PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的結(jié)果

移植后第5周，分別取PSB組、BMSC組大鼠肝臟行qRT-PCR，檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白RNA表達(dá)。

與BMSC組相比，PBS組大鼠肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白RNA表達(dá)均增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表3、圖5。

表3 BMSC、PBS組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原Tab.3 Type I and III collagen of rats in BMSC and PBS groups

注：*與BMSC組比較，P<0.05。

注：COL-1：Ⅰ型膠原；COL-3：Ⅲ型膠原。*P< 0.05。圖5 PBS、BMSC組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的qRT-PCR結(jié)果的比較Fig.5 the comparison of qRT-PCR results of type I and III collagen genes in PBS and BMSC groups

3 討論與結(jié)論

肝纖維化是肝臟中纖維結(jié)締組織異常增殖和積聚的一種病理狀態(tài)，是機(jī)體對于各種急慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)。多種損傷因素通過不同途徑導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡[10]，肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)合成增多分解減少失衡，出現(xiàn)病理性沉積，最終導(dǎo)致肝硬化、肝性腦病、門靜脈高壓、肝功能衰竭甚至死亡[11]。因此治療慢性肝病的關(guān)鍵是在祛除病因后，有效抑制肝纖維化進(jìn)程。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MSC具有減輕肝纖維化及改善肝臟功能的作用[4,5,12,13]。

MSC是中胚層來源的具有高度自我更新能力、多向分化潛能和低免疫原性的多能干細(xì)胞，而MSC在骨髓中含量較低，僅占骨髓中單核細(xì)胞0.002%～0.005%[14]。因此根據(jù)BMSC生物學(xué)特性，本研究采用全骨髓貼壁法分離擴(kuò)增BMSC，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSC表面標(biāo)志物CD29、CD90陽性率均高于95%，而CD45的陽性率僅為1.3%，符合BMSC細(xì)胞表面分子特征。焦艷等[15]于肝纖維化造模第6周、第8周移植BMSC，證實(shí)于造模第6周時(shí)移植BMSC肝纖維化評分明顯降低。而本研究分別于造模第5周、第6周、第7周后取大鼠肝臟行HE、Masson染色，發(fā)現(xiàn)造模第5周時(shí)門管區(qū)炎癥細(xì)胞大量浸潤，Masson染色可見匯管區(qū)血管周圍有膠原纖維沉積，有或無短的纖維間隔向細(xì)胞內(nèi)伸展，而第7周大鼠切片中可見匯管區(qū)血管周圍有膠原纖維沉積，同時(shí)在肝索間可見長短不一的纖維間隔且無肝內(nèi)假小葉形成，故本研究中選取造模后第8周移植BMSC。

在以往研究中發(fā)現(xiàn)，BMSC移植能夠減輕早期肝纖維化的纖維化程度、改善肝臟功能[4,5,12,13]。本研究選擇尾靜脈作為移植途徑，病理結(jié)果顯示BMSC移植后紊亂的肝小葉結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，纖維間隔變窄且數(shù)量減少，說明BMSC能夠有效減少肝內(nèi)膠原沉積，減輕纖維化程度。通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)BMSC組大鼠肝臟內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)低于PBS組，證實(shí)了細(xì)胞外基質(zhì)減少，纖維化形成得到有效控制。血清學(xué)指標(biāo)顯示BMSC組大鼠ALT、AST明顯低于PBS組(P<0.05)，且Alb較之升高(P<0.05)，說明BMSC移植后不僅能夠有效改善肝內(nèi)纖維化情況，還可以促進(jìn)肝細(xì)胞重生并且改善其功能。綜上所述，本研究證實(shí)了同種異體移植BMSC可以有效減少肝臟膠原沉積，改善肝纖維化大鼠肝臟功能。然而由于造模時(shí)間較短，肝纖維化程度未達(dá)到肝硬化程度，本研究尚不能說明BMSC移植對于晚期肝纖維化是否具有同樣療效。此外，MSC治療肝纖維化的機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為主要與肝星狀細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)合成降解平衡有關(guān)[6,16-18]。因此，對于MSC治療纖維化的機(jī)制需要進(jìn)一步研究，為臨床治療提供相應(yīng)動物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

近年來MSC已逐漸從動物實(shí)驗(yàn)走向臨床，為臨床肝纖維化提供了新的治療策略。在自身免疫性疾病、脊髓損傷、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病治療中，MSC也有良好的應(yīng)用前景。然而，目前不論是動物實(shí)驗(yàn)還是臨床試驗(yàn)對于MSC移植的安全性報(bào)道均較少，因此需要更多優(yōu)質(zhì)的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以確保干細(xì)胞治療的安全性和有效性，維護(hù)患者利益。

同種異體移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以改善肝纖維化大鼠肝功能，減輕大鼠肝纖維化程度。