UPLC-MS/MS法測定蜂蜜中4種喹諾酮類藥物殘留

□ 譚順中 程 燕 譚美齡 重慶市萬州食品藥品檢驗所

蜂蜜是蜜蜂從開花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中經(jīng)過充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，具有豐富的營養(yǎng)價值和較高的藥用價值。喹諾酮類藥物為人工合成的一類廣譜抗菌藥，具有抗菌譜廣、價格低、無交叉耐藥性等優(yōu)點，不僅在臨床有著極其廣泛的應(yīng)用，還被廣泛應(yīng)用在獸藥領(lǐng)域。由于喹諾酮類藥物在預(yù)防和治療過程中的不規(guī)范使用，許多動物源性食品常存在該類藥物的殘留[1]。我國農(nóng)業(yè)部為保障動物產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全也于2015年決定在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。

本研究擬通過建立UPLC-MS/MS法對50批蜂蜜中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種喹諾酮類藥物殘留進行測定，對我國在食品動物中停止使用這4種藥物以來，蜂蜜中這四種藥物的殘留情況進行小范圍的調(diào)查研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum Access Max超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、IKA? MS 3 digital渦 旋 振 蕩 器 ，Biotage Tulbovap ? LV 氮吹濃縮儀。

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（均為100 μg/mL）,諾氟沙星 -D5對照品（10μg/mL）；甲醇（色譜純）、乙酸銨（優(yōu)級純）、超純水。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜和質(zhì)譜條件

Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）。流動相：A.5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸水溶液），B.甲醇。梯度洗脫：0～2.0 min，流動相 A 為 90% 并 保 持 ，2.0～3.5 min，流動相A從90%線性變至10%，并保持至 4.5 min。6.5～6.6 min，流動相B從90%線性回至10%，并保持至10 min。流速：0.20 mL/min。進樣量：5 μL。柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件見表1。

表1 質(zhì)譜條件

1.2.2 樣品采樣

蜂蜜樣品來至重慶市3個區(qū)縣（萬州、云陽、開州），采樣環(huán)節(jié)主要為超市、小賣店、農(nóng)貿(mào)市場等流通環(huán)節(jié)以及蜜蜂養(yǎng)殖戶等生產(chǎn)環(huán)節(jié)，主要品種為洋槐蜜、油菜花、椴樹、棗花蜜等10種蜂蜜，共計50份樣品。

1.2.3 工作曲線的繪制

準(zhǔn)確移取適量的喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋并配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1μg/mL）。用空白樣品基質(zhì)溶液配制濃度為1.0、5.0、10、20、50 ng/mL 的基質(zhì)工作曲線，其中諾氟沙星D5內(nèi)標(biāo)濃度為20 ng/mL，均以內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.4 樣品處理

稱取2.0 g蜂蜜樣品于50 mL離心 管 中 ，加 入 200 μL 1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液（諾氟沙星D5），加入10 mL 80%甲醇水溶解，振蕩混勻，過prime HLB柱凈化，流出液在40 ℃氮吹濃縮至近干。用1 mL 初始流動相復(fù)溶，渦旋過0.22 μm濾膜，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，本研究選擇了MCX陽離子交換固相萃取小柱、HLB、PRiME HLB三種固相萃取柱進行凈化，通過加標(biāo)回收比較[2]。從回收率來看，HLB固相萃取柱和PRiME HLB萃取柱的回收率差不多，而MCX陽離子交換柱的回收率偏低。從過柱過程來看，HLB固相萃取柱和MCX陽離子交換柱均存在易堵塞凈化柱，速度慢，需經(jīng)過活化-淋洗-洗脫等步驟，耗時較長，重現(xiàn)性不理想等問題。而Oasis PRiME HLB 固相小柱是在Oasis HLB 固相小柱技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的新一代反相固相萃取柱，屬于過濾性除去雜質(zhì)固相小柱，可以有效地吸附樣品中蛋白質(zhì)和磷脂類物質(zhì)，較以往HLB固相萃取柱具有更簡單、更快速優(yōu)勢[3]。

因此本研究前處理采用PRiME HLB一步法提取和凈化蜂蜜樣品，前處理簡單，并且基質(zhì)干擾較小、靈敏度較高，能得到較為滿意的效果。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍、定量限和檢出限

以峰面積對對照品濃度（ng/mL）進行回歸分析，在濃度范圍為1.0 ng/mL～50 ng/mL，4種化合物曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.996～0.999。按S/N=3計算檢出限，檢出限均為：1.0 μg/kg。

圖1 10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、諾氟沙星-D5 TLC圖及提取離子通道質(zhì)譜圖

2.2.2 回收率和精密度

在經(jīng)測定不含洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種喹諾酮類藥物陰性樣品中進行回收率和精密度試驗。在陰性樣品中添加低中高3個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進行實驗，回收率范圍為72.48%～103.22%，RSD均不大于10.0%。

2.3 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法對50批蜂蜜進行了分析測定，樣品種類洋槐蜜、油菜花、椴樹、棗花蜜等10種蜂蜜。50批樣品中均未檢出洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種喹諾酮類藥物[4]。

3 結(jié)論

本文建立了UPLC-MS/MS法測定蜂蜜中4種喹諾酮類藥物殘留，蜂蜜樣品用80%甲醇水溶解，經(jīng)PrimeHLB固相萃取柱凈化，超高效液相電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法前處理簡單，且基質(zhì)干擾較小、靈敏度較高，能得到較為滿意的結(jié)果。50批蜂蜜樣品測定結(jié)果表明洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種喹諾酮類藥物在本次抽檢的區(qū)域控制情況良好。