黃芪、黨參水提物對自制臘腸中5種腐敗菌的抑菌活性的研究

□ 楊海雁 于喆源 張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院

臘腸是中國傳統(tǒng)特色食品之一，主要靠原料肉自身的微生物與環(huán)境微生物的競爭作用完成發(fā)酵過程，發(fā)酵方式屬于自然發(fā)酵[1-2]，因?yàn)楹胸S富的蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)，在貯藏過程中容易受到微生物污染，從而引發(fā)產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。工業(yè)化生產(chǎn)臘腸會通過添加化學(xué)防腐劑來抑制香腸中腐敗菌等微生物的生長，自制臘腸的防腐敗則主要是通過自身的高鹽分對微生物生長進(jìn)行抑制[3-4]。

黃芪、黨參作為食藥同源植物，在賦予食物特殊風(fēng)味的同時，具有重要的保健作用，李瑜[5]、代建麗[6]等學(xué)者的研究已經(jīng)表明，上述中藥材的水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、黑曲霉與霉菌等微生物具有明顯的抑制作用?？疾焐鲜鏊幉牡囊志钚?，對發(fā)展健康安全食品和提高上述天然植物的綜合利用途徑具有重要意義。為此，本研究嘗試通過篩選、鑒定自制臘腸中的腐敗菌，并利用黃芪、黨參水提物作用于腐敗菌，研究上述提取物對不同種類臘腸腐敗菌的抑菌效果，找出上述水提物對腐敗菌的最低抑菌濃度（MIC），并總結(jié)其規(guī)律，找到上述中藥材作為臘腸防腐劑的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自制無添加臘腸：購于張掖新樂超市；PCA平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、0.9%無菌生理鹽水溶液：青島高科園海博生物技術(shù)司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動微生物鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃；LMQ.C全自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；BHC-1300ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；S PX-250生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有效成分的提取

近幾年發(fā)展的新型技術(shù)有超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波法和生物酶解法。不同方法對黃芪、黨參水提物的提取效果，已有多位學(xué)者[7-8]進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)選擇超聲波輔助提取法，以水為溶劑對上述兩種植物進(jìn)行提取。具體過程為：分別稱取上述干燥藥材粉末（過65目篩網(wǎng)）約150 g，加入10倍量的80%乙醇回流2 h，過濾，棄去濾液，濾渣以水作為提取溶劑，料液比1∶10（g/V），在超聲溫度50 ℃，超聲波功率500 W、提取時間45 min的條件下提取，經(jīng)過濾后，濾液加入乙醇至乙醇濃度為80%（V/V）,靜置沉淀48 h，濾過，

濾渣即為粗水提物產(chǎn)物。

1.3.2 臘腸的加速腐敗及腐敗菌的分離

將自制臘腸剝?nèi)ツc衣后在環(huán)境中放置72 h，相對濕度50%，35 ℃下進(jìn)行加速腐敗培養(yǎng)，5 d后切取腐敗后的香腸10 g加入100 mL含0.9%無菌生理鹽水溶液的均質(zhì)袋中制成樣品菌懸液，充分拍打混勻，稀釋至10-6～10-7CFU/mL后，分別取0.1 mL樣品液于PCA平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上，涂布均勻后將細(xì)菌放置在37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，霉菌放置在28 ℃下培養(yǎng)3～5天。用接種環(huán)挑取菌落數(shù)在30～300的平皿上的典型菌落，然后進(jìn)行四區(qū)劃線培養(yǎng)，反復(fù)劃線純化所得的菌落，最終得到純化的單菌落。將經(jīng)過純化處理的菌種進(jìn)行試管斜面劃線保存。

1.3.3 腐敗菌種的鑒定

采用形態(tài)學(xué)檢定與全自動微生物分析儀進(jìn)行微生物菌種鑒定。形態(tài)學(xué)觀察：觀察平板上單菌落的形態(tài)特性，利用文獻(xiàn)中的菌落形態(tài)學(xué)特征，記錄平板上單菌落的菌落形態(tài)特性，對腐敗菌種進(jìn)行初步判斷。生理生化鑒定：利用全自動微生物鑒別系統(tǒng)，對被測菌進(jìn)行多組生化試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參考《常見與常用真菌》[9]《細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]《伯杰氏細(xì)菌手冊》[11]中對細(xì)菌的生化特征鑒定的有關(guān)描述，對待腐敗菌進(jìn)行分類鑒定。

1.3.4 抑菌試驗(yàn)

1.3.4.1 菌懸液制備

用接種環(huán)沾取少量保存在斜面培養(yǎng)基上的菌種放入含10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基試管中，細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，霉菌于28 ℃培養(yǎng)3～5天。然后用無菌生理鹽水稀釋，稀釋梯度為 10-1、10-2、10-3、10-4與10-5，充分混勻，吸取100 μL在平皿底部，倒入冷卻至45 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL左右，搖勻，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，找出合適的梯度，使菌懸液的濃度達(dá)到106～107CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 溶液的制備

將水提物樣品用純化水溶解并用薄膜過濾法除菌后，分別配成質(zhì)量濃度 為 0.1、0.2、2.0、20.0 mg/mL與80.0 mg/mL的水提物溶液。

1.3.4.3 水提物的抑菌試驗(yàn)

取制備好的菌懸液用涂布法[12]檢驗(yàn)抑菌效果。向平皿中倒入冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，待凝固后，分別加入100 μL菌懸液和100 μL不同濃度的水提物溶液，用一次性L棒涂抹均勻。每個菌種設(shè)2個平行組，將涂布好的平板倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌在28 ℃培養(yǎng)72 h）后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.4.4 最低抑菌濃度（MIC）測定

將經(jīng)過過濾除菌的濃度為0.01、0.03、0.06、0.08 mg/mL與 0.10 mg/mL的水提物溶液，定量加入到裝有10 mL TSB液體培養(yǎng)基的試管中，然后吸取40 μL菌液加入至同一試管中，混勻。同時做一個空白和一個只加樣品的對照。將試管放在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落的生長狀況。以試管中肉眼可見濁度明顯低于樣品組濁度的濃度為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)過涂布和劃線培養(yǎng)配合革蘭氏染色，初步篩選出2種細(xì)菌和3種真菌，分別命名為J-1、J-2、J-3、J-4和J-5，其形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和生理生化鑒定結(jié)果見表1和圖1，參考《常見與常用真菌》《細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌手冊》中對細(xì)菌和霉菌的生理生化特征鑒定的有關(guān)描述。結(jié)合對5種菌的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果，判斷出5種菌分別為陰溝腸桿菌，托爾豪特鏈球菌、酵母菌、黑根霉與米曲霉。因?yàn)槊咕饕切螒B(tài)學(xué)觀察加之孢子傳播性強(qiáng)，無法完全分離純化，所以霉菌在一張平皿上觀察，結(jié)果如圖1。對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果如圖2。

表1 5種腐敗菌形態(tài)學(xué)特征

圖1 菌落形態(tài)

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖

2.2 水提物抑菌試驗(yàn)結(jié)果

通過測定不同濃度黃芪、黨參2種植物粗水提物作用下，5種腐敗菌菌落數(shù)的數(shù)目來判斷黃芪、黨參水提物對所篩選細(xì)菌的抑制效果，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2可以看出，上述兩種植物水提物對篩選出的5種菌均能起到較好的抑制作用，抑制作用隨濃度的增大先增加后減小并趨于平穩(wěn)?？傮w而言，兩種水提物對真菌的抑制效果強(qiáng)于細(xì)菌。

當(dāng)黃芪水提物質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時，對5種菌的抑制效作用最弱，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，抑菌作用最明顯。當(dāng)黨參水提物質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時，對5種菌的抑制效作用最弱，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.01 mg/mL時，抑菌作用最明顯，且對酵母菌的抑制作用明顯強(qiáng)于其他菌。原因可能是[13-15]：濃度較低時，滲透壓較低，對菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性影響較小，隨著濃度的增大，滲透壓增大，引起細(xì)胞內(nèi)容物外泄，對菌的生長起到抑制作用，而當(dāng)濃度過大時，由于單位體積的溶劑對樣品的溶解度達(dá)到飽和，使得水提物的溶解和擴(kuò)散受到了限制，進(jìn)而影響了抑菌性。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果

由表3可知，水提物的濃度增大到一定值時，培養(yǎng)物中菌落的生長情況明顯弱于樣品組，此即水提物對該菌的最低抑菌濃度。由下表可知，黃芪水提物對陰溝腸桿菌和托爾豪特鏈球菌的最低抑菌濃度為0.06 mg/mL，對酵母菌、黑根霉、米曲霉的最低抑菌濃度為0.03 mg/mL；黨參水提物對陰溝腸桿菌和托爾豪特鏈球菌的最低抑菌濃度為0.08 mg/mL，對酵母菌、黑根霉、米曲霉的最低抑菌濃度為0.06 mg/mL。上述結(jié)果表明兩種水提物對兩種細(xì)菌的抑制能力較三種真菌稍差。

表2 黃芪、黨參水提物對5種腐敗菌抑菌效果

表3 黃芪、黨參水提物對5種腐敗菌最低抑菌濃度（MIC）

3 結(jié)論

通過對自制臘腸中5種腐敗菌的形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定，表明5種細(xì)菌分別為陰溝腸桿菌、托爾豪特鏈球菌、酵母菌、黑根霉與米曲霉。黃芪、黨參水提物對所篩選出的5種腐敗菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表示：黃芪粗水提物在質(zhì)量濃度0.03 mg/mL時，開始對5種腐敗菌表現(xiàn)出抑菌效果；黨參粗水提物在質(zhì)量濃度0.06 mg/mL時，開始對5種腐敗菌表現(xiàn)出抑菌效果。兩種水提物對酵母菌、黑根霉、米曲霉菌的抑菌效果較陰溝腸桿菌、托爾豪特鏈球菌明顯。我國的黃芪、黨參資源非常豐富，可作為天然抑菌物質(zhì)的來源，本研究為黃芪、黨參水提物作為一種防腐劑以食品添加劑的形式添加到食品中提供了一定的理論依據(jù)。