同時檢測茶葉中5種兒茶素和咖啡因的QuEChERS-HPLC方法研究

□ 嚴開芹 曾小平 向君毅 廣東省清遠市食品檢驗中心

1 引言

茶多酚和生物堿是茶葉中重要的活性成分，兒茶素是茶多酚的主要成分，占茶多酚含量的60%～80%，也是主要的藥理活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用[1-4]，其中兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EG C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與表兒茶素沒食子酸酯（ECG）是影響茶葉品質(zhì)和質(zhì)量的重要指標，國家標準[5]對綠茶中以上5種兒茶素的含量進行了規(guī)定?？Х纫蚴巧飰A的主要組成成分，是茶葉重要的風(fēng)味物質(zhì)和生理活性成分，具有消除疲勞、興奮神經(jīng)的作用[6]，但人體過量攝入會產(chǎn)生不良影響[7]，同時，咖啡因也是影響茶葉品質(zhì)的重要指標，因而建立一種快速測定茶葉中兒茶素類和咖啡因的檢測方法很有必要。

目前，國家標準和文獻報道的兒茶素類和咖啡因的檢測方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[8-12]，但國家標準和一些文獻報道的方法存在流動相復(fù)雜[13]、分析時間長和缺少樣品凈化步驟[14-15]等問題。而茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，除茶多酚和生物堿外，還含有色素、蠟質(zhì)等成分，這些成分不僅影響兒茶素類和咖啡因的檢測效果，還容易在色譜柱上殘留，造成柱壓升高、色譜柱污染、柱效降低等問題，影響儀器的后續(xù)使用；有些文獻報道了基于固相萃取的前處理凈化方法[16]，但該前處理方法存在商品化小柱價格昂貴、處理時間長、不能批量處理等缺點。而QuEChERS作為一種較新的前處理方法，具有快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全的特點，其原理是利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)的相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化的目的。本文針對國家標準和文獻中檢測兒茶素和咖啡因方法存在的缺陷，首次采用QuEChERS方法結(jié)合HPLC，建立了茶葉中兒茶素類和咖啡因的檢測方法，此方法具有操作簡單、準確性高、流動相系統(tǒng)簡單與分析時間短的優(yōu)點，并能滿足分析的要求，能夠為茶葉的等級評價和質(zhì)量控制提供更準確的科學(xué)數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒 食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）與咖啡堿（CAF）購于中國廣州分析測試中心（規(guī)格均為20 mg/盒）；甲醇（色譜純），迪馬公司；乙二胺-N-丙基硅氧烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、氧化鋁（Al2O3）、石墨化炭黑（GCB），Agela Technologies公司；其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀（配有PDA檢測器）、Syncronis C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），賽默飛公司；恒溫水浴鍋，上海精宏；離心機，長沙湘智。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品前處理

稱取0.2 g（精確到0.000 1 g）均勻磨碎的茶葉樣品試樣于50 mL離心管中，加入70 ℃下預(yù)熱過的70%甲醇溶液5 mL，用玻璃棒充分攪拌均勻濕潤，立即移入70 ℃水浴中浸提10 min（隔5 min攪拌一次），浸提后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入離心機，在3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min[17]，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中。殘渣用5 mL的70%甲醇水溶液提取一次，重復(fù)上述操作，合并提取液，于容量瓶中定容至50 mL，搖勻。取上清液5 mL置于另一50 mL離心管中，加入吸附劑PSA 25 mg和C18200 mg，渦旋2 min，3 500 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾待上機。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Syncronis C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流 動 相： 甲醇-1.25%乙酸溶液；梯度洗脫程序（見表1）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：278 nm；進樣量：10 μL。

2.2.3 提取和凈化條件的優(yōu)化

尤其是隨著學(xué)校的擴大，學(xué)生人數(shù)大幅度增加，專業(yè)設(shè)置也大幅度增多，管理和教學(xué)的工作量增大，學(xué)科專業(yè)由單一走向多元，同時在教學(xué)工作上也存在極大的不平衡。這就導(dǎo)致在學(xué)校層面要組建一個比較專業(yè)的教學(xué)督導(dǎo)隊伍也是很困難的一件事，使得學(xué)校層面的教學(xué)督導(dǎo)隊伍在專業(yè)結(jié)構(gòu)、職業(yè)結(jié)構(gòu)、個人認識等方面存在著諸多不協(xié)調(diào)的現(xiàn)象。

通過預(yù)實驗選取對兒茶素類和咖啡因含量影響最大的4個因素做正交實驗，分別為：吸附劑的種類、含量、水浴溫度與提取溶劑質(zhì)量分數(shù)。設(shè)計正交試驗，以兒茶素類和咖啡因含量為指標，采用L9（34），找出最佳的提取凈化條件。因素水平表見表2。

2.2.4 方法學(xué)考察

在上述優(yōu)化后的最佳實驗條件下進行方法學(xué)驗證，包括線性關(guān)系、方法檢出限、方法定量限、加標回收率、精密度。

回收率的計算公式如式（1）。

式（1）中：Z—回收率（%）；X—樣品中兒茶素類和咖啡因的含量（mg/kg）；M—空白樣品中兒茶素類和咖啡因的含量（mg/kg）；Y—樣品的加標量（mg/kg）。

樣品中兒茶素類和咖啡因含量的計算公式見式（2）。

式（2）中：C—兒茶素類和咖啡因的含量，%；ρ—樣品中兒茶素類和咖啡因的濃度，μg/mL；m—樣品的稱樣量，g。

精密度的計算公式見式（3）（4）。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑的選擇

分別選取甲醇、乙醇、水對茶葉中的兒茶素類組分和咖啡因進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用純水作提取溶劑時，樣品提取不充分，兒茶素類組分和咖啡因提取含量僅為甲醇提取含量的60%；用乙醇作提取溶劑時，樣品提取液中有雜質(zhì)干擾，目標峰峰型不呈正態(tài)分布；用甲醇作提取溶劑時，樣品中兒茶素類組分和咖啡因提取率更高，且各組分峰型均呈正態(tài)分布。

3.1.2 提取溶劑質(zhì)量分數(shù)的選擇

分別選取20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇與100%甲醇對樣品中的兒茶素類組分和咖啡因進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甲醇質(zhì)量分數(shù)為20%～80%時，樣品中兒茶素類和咖啡因的含量隨著甲醇質(zhì)量分數(shù)的增加而增加，當甲醇的質(zhì)量分數(shù)增加到100%時，樣品中兒茶素類和咖啡因的含量有降低趨勢。這可能是因為相對于純甲醇溶劑，兒茶素和咖啡因更容易溶于甲醇水溶液。

3.1.3 提取溶劑的pH值的選擇

分別選取pH為2.5的80%甲醇、pH為4的80%甲醇、pH為6的80%甲醇與pH為7.5的80%甲醇對樣品中的兒茶素類組分和咖啡因進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當pH在4～6時，樣品中的5種兒茶素類和咖啡因較穩(wěn)定，當pH＜4時，EGC含量降低較多，pH＞6時，EGC和EGCG含量降低明顯。

3.1.4 凈化劑種類和含量的選擇

分別選取PSA、C18、Al2O3、GCB 4種凈化劑，在4個用量水平（50、100、200 mg與400 mg）下對樣品進行凈化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用GCB和Al2O3凈化時，隨著用量的增加，對5種兒茶素和咖啡因的吸附均越來越強，5種兒茶素和咖啡因提取量下降明顯。C18對5種兒茶素和咖啡因的吸附作用較弱，當C18含量為200 mg時，凈化液顏色較淺，C18含量小于200 mg時，凈化液顏色較深；PSA在50 mg時對5種兒茶素和咖啡因的吸附作用較低，且隨著PSA含量的增加對5種兒茶素和咖啡因的吸附作用有遞增趨勢，見圖1；因此本實驗選取C18和PSA作為凈化劑。

3.1.5 提取條件和凈化劑用量的優(yōu)化

采用正交實驗對茶葉中5種兒茶素和咖啡因的提取條件和凈化劑用量進行優(yōu)化。設(shè)計四因素三水平的正交試驗L9（34），以5種兒茶素和咖啡因的平均含量為考察指標，結(jié)果見表2。

表1 梯度洗脫程序

圖1 吸附劑對5種兒茶素和咖啡因的吸附作用

表2 正交實驗結(jié)果

由R值大小可知，影響5種兒茶素和咖啡因回收率的因素順序為A（甲醇質(zhì)量分數(shù)）＞C（PSA）＞B（pH）＞D（C18）。選擇各因素k值最大的水平，確定出茶葉最佳的提取和凈化條件為A3B1C1D2，即甲醇質(zhì)量分數(shù)為80%，pH值為4，PSA為25 mg，C18為200 mg，此時平均回收率為98.31%。

3.2 流動相的選擇

采用梯度洗脫分別比較了國家標準流動相[18]、甲醇-水、甲醇-1.25%乙酸銨溶液作為流動相對6種目標物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用國家標準流動相[19]、甲醇-水時，6種目標物不能完全分離，且有些物質(zhì)峰缺失，不能進行有效洗脫；用甲醇-1.25%乙酸獲得的色譜圖見圖2。從圖2可以看出，5種兒茶素和咖啡因的分離效果好，分析時間短，各物質(zhì)峰分離度均大于1.5，且峰型較好。

圖2 5種兒茶素和咖啡因標品色譜圖

表3 5種兒茶素和咖啡因的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

圖3 5種兒茶素和咖啡因樣品加標色譜圖

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系和方法檢出限

對5種兒茶素和咖啡因標準品進行逐級稀釋，配制成濃度為1、5、20、50、100、200、500、800 μg/mL與1 000 μg/mL的工作液，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。由表3可知，5種兒茶素和咖啡因的線性現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均達0.999。

3.3.2 加標回收率、相對標準偏差

在0.2 g茶葉樣品中添加適量5種兒茶素和咖啡因標準溶液，每個添加量設(shè)置3個平行，進行加標回收率實驗、回收率、相對標準偏差，結(jié)果見圖3和表4 。

結(jié)果表明，3份平行樣品中，5種兒茶素和咖啡因的平均回收率均大于93%；相對標準偏差在1.45%～1.85%。

4 實際樣品分析

采用本方法對市售的茶葉（紅茶和綠茶）中的5種兒茶素和咖啡因進行了檢測，結(jié)果見表5。

從表5可看出，紅茶和綠茶均檢出5種兒茶素和咖啡因，其中兩類茶葉咖啡因含量相當，紅茶在發(fā)酵過程中兒茶素發(fā)生氧化，5種兒茶素總量，尤其是EGCG明顯低于紅茶；此外同類品種不同等級的茶葉因加工工工藝不同，5種兒茶素含量也有較大差異。

5 結(jié)論

建立了茶葉中5種兒茶素（C、EC、EGC、EGCG、ECG）和咖啡因的QuEChERS-HPLC檢測方法，相比于國家標準方法，該方法中采用的流動相更簡單、分析時間更短，而且僅需12 min即可完成對樣品的分析，且分離度更好。該方法通過提高甲醇的質(zhì)量分數(shù)從而提高了兒茶素的含量，通過控制提取液pH，增加了兒茶素組份的穩(wěn)定性；與文獻報道的商品化固相萃取前處理凈化相比，QuEChERS方法可批量處理樣品、節(jié)約人力、且成本更低，優(yōu)勢明顯。因此本文所建立的方法具有快速、簡單、適用于批量處理及實用性強等特點，為監(jiān)控茶葉質(zhì)量和為消費者合理選擇提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表4 種兒茶素和咖啡因的平均加標回收率、相對標準偏差

表5 樣品分析結(jié)果