蘇太豬源TTP基因的克隆及其遺傳進化分析

陳 榮，張喜懿，田 浪，溫貴蘭*，祝 景，晏旭紅，付尚林

(1.貴州大學動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴州 貴陽 550016)

鋅指蛋白是1類重要的轉錄因子，廣泛存在于真核轉錄基因組中，在生命過程中發(fā)揮著重要作用，如細胞分化、胚胎發(fā)育等，主要與RNA和DNA相互作用[1]。Berg[2]等依據(jù)鋅指蛋白在功能和序列上的不同將其分為9類，CCCH型(C和H分別代表半胱氨酸和組氨酸)是其中1類，而CCCH型中研究最多的是Tristetraproin(TTP)。TTP開放閱讀框為981 bp，共編碼326個氨基酸，最早發(fā)現(xiàn)于纖維原細胞中，是對血清和胰島素響應的早期基因蛋白產(chǎn)物，通常存在于核靜止細胞，蛋白表達水平較低，但在血管生成過程中的極早期表達水平比較高，促進血管的生成[3]。TTP是1種ARE(AU-rich element)結合蛋白，功能明確，可與一些炎性因子mRNA上的ARE結合，降低mRNA的半衰期，在炎癥和病毒感染中有重要的負調控作用[4]。近年來的研究表明，TTP可以調節(jié)免疫應答，具有抑癌基因功能，對腦水腫起保護作用，TTP可作為HIV-1(Human immunodeficienvy virus 1)復制和AHRR(Aryl hydrocarbon receptor repressor)的調控因子；TTP水平降低在糖尿病性腎病中可作為早期腎損害標記之一等[5～9]。蘇太豬是我國培育的國家級瘦肉型新品種，具有性成熟早、性情溫順、耐粗飼、肉味香等優(yōu)點，近年來關于蘇太豬肉質和繁殖能力研究的內(nèi)容較多，而對其基因研究較少[10]。本試驗通過RT-PCR技術成功擴增出蘇太豬源TTP基因CDS區(qū)，并進行克隆及序列測定、遺傳進化分析，以期為深入研究蘇太豬源TTP基因的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，購自碧云天生物技術公司；RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉錄試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司；pMD-19T載體、2×ESTaqMaster Mix、連接酶SolutionⅠ，購自寶生物工程(大連)有限公司；蘇太仔豬血，采自貴州省黔東南州某養(yǎng)殖公司。

1.2 方法

1.2.1引物設計及合成：根據(jù)GenBank公布的野豬源TTP基因 (登錄號：HM480487.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設計了1對特異性引物。引物序列為：TTP-EcoRV-5’flag-F：CGGATATCTATGGATCT CACCGCCATCTACG;TTP-NotI-5’flag-R：GCGCG GCCGCTTACTCAGAAACAGAAATACG。下劃線部分為酶切位點，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2蘇太豬血液總RNA的提取與反轉錄：根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取蘇太豬血液總RNA；根據(jù)反轉錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉錄成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.3PCR擴增：以所得cDNA為模板進行TTP基因PCR擴增，反應體系20 μL：上、下游引物(3.3 nmol/L)各1 μL，cDNA 2 μL，2×ESTaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。反應程序：95 ℃預變性 4 min，95 ℃變性40 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，預擴增片段大小981 bp。

1.2.4克隆與測序：將PCR產(chǎn)物根據(jù)膠回收試劑盒進行膠回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接。連接體系12 μL：連接酶Solution Ⅰ 6 μL，純化的PCR產(chǎn)物5 μL，pMD-19T載體1 μL。連接條件：16 ℃過夜。將全部連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，并加入LB液體培養(yǎng)基750 μL，于37 ℃ 150 r/min搖床中培養(yǎng)1.5 h，取出至4 ℃離心機上以5 000 r/min離心5 min，棄去上清，留菌液200 μL，將菌液與沉淀混合后均勻涂布于含氨芐的 LB 固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，以單個菌落純培養(yǎng)后的菌液為模板進行PCR檢測并提取菌液質粒進行雙酶切鑒定。雙酶切體系 20 μL：NotI 1 μL，EcoRV 1 μL，BSA 2 μL，10xH 2 μL，重組質粒cDNA 10 μL，ddH2O 4 μL。雙酶切條件：37 ℃ 4～8 h。經(jīng)菌液PCR和雙酶切技術鑒定為陽性的重組質粒送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.5遺傳進化分析：采用NCBI網(wǎng)站的 BLAST與DNAStar軟件包中的MegAlign比對測序所得TTP基因與GenBank中公布的野豬、羊駝、單峰駱駝等不同種源TTP基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并構建系統(tǒng)進化樹。參考序列見表1。

表1 參考序列信息

2 結果與分析

2.1PCR擴增結果對反轉錄合成的蘇太豬血液cDNA進行TTP基因PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示在約981 bp處出現(xiàn)特異性條帶(見圖1)，與預期擴增片段大小相符合。

圖1 蘇太豬源TTP基因PCR擴增結果M：2 000 DNA Marker；1～3：TTP擴增片段；4：陰性對照

2.2 克隆結果將PCR產(chǎn)物膠回收后，與pMD-19T載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，以單個菌落純化后的菌液為模板進行PCR擴增，并對重組質粒進行雙酶切鑒定，結果分別見圖2、圖3。由圖2可見，菌液PCR獲得大小約981 bp的特異性條帶，與預期擴增條帶大小相符。由圖3可見，重組質粒酶切獲得約2 692 bp的載體條帶和981 bp的目的條帶，可初步判斷目的基因成功克隆至pMD-19T載體。

圖2 蘇太豬源TTP基因菌液PCR擴增結果M：2 000 DNA Marker；1：陰性菌液；2、3：陽性菌

圖3 蘇太豬源TTP基因雙酶切鑒定結果M：2 000 DNA Marker；1、2：重組質粒

2.3TTP基因測序結果將陽性重組質粒送北京六合華大基因科技有限公司測序，結果可見：蘇太豬源TTP基因CDS區(qū)長為981 bp，其堿基組成見表2，其中C堿基的含量最高為40.37%，A堿基的含量最低為15.49%。

表2 TTP基因核苷酸序列分析

2.4 遺傳進化分析

2.4.1蘇太豬源TTP基因的同源性分析：將克隆后的蘇太豬源TTP基因核苷酸序列與GenBank中預測公布的13株不同種源的TTP基因利用DNAStar軟件包中MegAlign進行同源性比對。由圖4可見，蘇太豬源TTP基因核苷酸序列與野豬源TTP基因的同源性最高(99.8%)，僅有0.2%的變異度；其次是與羊駝TTP基因的核苷酸序列具有較高的一致性(92.8%)；與非洲巨頰囊鼠的核苷酸同源性最低(84.8%)。由圖5可見，蘇太豬源TTP基因氨基酸序列與參考序列野豬源氨基酸同源性完全一致，與小家鼠的氨基酸同源性最低(88.7%)。

圖4 不同種源TTP基因核苷酸序列的同源性比對

圖5 不同種源TTP基因氨基酸序列的同源性比對

2.4.2系統(tǒng)進化樹分析：利用DNAStar程序包中MegAlign軟件構建不同種源TTP基因核苷酸序列和氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。由圖6、圖7可見，蘇太豬源TTP基因與參考序列野豬源(HM480487.1)TTP基因在遺傳進化樹上處于同一小分支，親緣關系最近；與牛、綿羊的親緣關系次之；與白鱀豚、虎鯨的親緣關系最遠。

圖6 蘇太豬源TTP基因核苷酸系統(tǒng)進化樹分析

圖7 蘇太豬源TTP基因氨基酸系統(tǒng)進化樹分析

3 結論

本試驗研究表明，蘇太豬源TTP基因CDS全長981 bp，共編碼 326個氨基酸，C堿基含量最高(40.37%)，A堿基含量最低(15.49%)。同源性比較發(fā)現(xiàn)，蘇太豬源TTP基因核苷酸序列和氨基酸序列與野豬源(HM480487.1)TTP基因具有非常高的一致性。系統(tǒng)進化樹顯示，本次擴增的蘇太豬源TTP基因與野豬源(HM480487.1)TTP基因在遺傳進化樹上處于同一小分支，親緣關系最近，與白鱀豚、虎鯨的親緣化關系最遠。同源性分析結果與系統(tǒng)進化樹分析結果一致，表明TTP基因在同種屬之間具有高度保守性。本試驗首次對蘇太豬源TTP基因的CDS區(qū)進行了克隆，并對該基因進行了遺傳進化分析，為進一步了解蘇太豬源TTP基因的生物學特性和功能奠定了理論基礎。