氫質(zhì)子磁共振波譜活體檢測(cè)結(jié)腸癌耐藥性及其分子標(biāo)志物的探索

謝琦，陳惠嫻，杜磊，廖炎輝，譚智霖，楊逸銘，吳敏儀，潘奇鋒，，吳錦斌，，張鼎旋，

磁共振波譜分析(magnetic resonance spectroscopy，MRS)是利用化學(xué)位移理論與磁共振技術(shù)相結(jié)合，定量分析人體內(nèi)特定化合物濃度的一種無(wú)創(chuàng)傷性MRI檢測(cè)技術(shù)。利用MRS可檢測(cè)出腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性前后某些代謝物的變化，對(duì)檢測(cè)腫瘤耐藥性改變的分子標(biāo)志物可能起到重要作用。本研究探索氫質(zhì)子磁共振波譜(1H-MRS)活體檢測(cè)人類(lèi)結(jié)腸癌耐藥性的可能。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作

1.1.1 人類(lèi)結(jié)腸癌SW480/5-FU耐藥細(xì)胞系的建立[1]

人類(lèi)結(jié)腸癌SW480親本細(xì)胞系(購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù))用完全新鮮培養(yǎng)液于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

采用大劑量沖擊法誘人類(lèi)結(jié)腸癌SW480耐藥細(xì)胞株：SW480親本細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)， 將培養(yǎng)液換為含有6μg/mL 5-FU的培養(yǎng)液，沖擊培養(yǎng)24 h撤藥，換為正常完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，1～2 d換液一次，待細(xì)胞重新恢復(fù)正常增殖，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后繼續(xù)以此濃度劑量沖擊培養(yǎng)誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株，培養(yǎng)6個(gè)月，獲得能夠在6 μg/mL 5-FU濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)的人類(lèi)結(jié)腸癌SW480耐藥細(xì)胞株，命名為SW480/5-FU。

MTT比色法檢測(cè)人類(lèi)結(jié)腸癌親本SW480、耐藥SW480/5-FU細(xì)胞IC50，耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=SW480/5-FU IC50∶SW480 IC50=20.594 μg/mL∶4.639μg/mL=4.44。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作[1]

16只健康的BALB/c裸小鼠，雌性，5～6周，16～18 g，隨機(jī)分為兩組(各8只)，用安爾碘消毒后，分別于裸鼠雙側(cè)大腿根部皮下注入SW480(不耐藥組)與SW480/5-FU (耐藥組)細(xì)胞懸液(0.2 mL/只，細(xì)胞濃度為4×107/mL)，定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，取最大徑大于1.5 cm以上的腫瘤進(jìn)行磁共振檢查。

1.2 荷瘤鼠MR檢查[1]

采用SIEMENS公司MAGNETOM Skyra-3.0 T超導(dǎo)型磁共振成像儀與動(dòng)物線(xiàn)圈(上海辰光)行以下序列檢查。

1.2.1 T2WI快速自旋回波

TR/TE=4500 ms/110 ms，層厚2 mm，間隔0，F(xiàn)OV 128 mm，NAS 4，加速因子2，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，行軸位、冠狀、矢狀位成像，成像時(shí)間=2 min 2 s (圖1)。

1.2.21H-MRS數(shù)據(jù)采集

采用PRESS序列，譜線(xiàn)帶寬1000 Hz，翻轉(zhuǎn)角90°，手動(dòng)勻場(chǎng)、抑水；多體素三維容積采集(3-demensional multi voxel，3D MV)：TR/TE=1700 ms/135 ms，層厚2 mm (根據(jù)腫瘤大小調(diào)整)，間隔0，F(xiàn)OV 60 mm，VOI 30 mm，采集體素邊長(zhǎng)10 mm，NAS 8，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，成像時(shí)間=9 min 13 s (圖2)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

1H-MRS所得數(shù)據(jù)經(jīng)西門(mén)子磁共振成像儀工作站處理，結(jié)合T2WI軸位和冠狀位定位像，得到圖像上能最大范圍覆蓋腫瘤的采集體素生成MRS譜線(xiàn)圖，系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出所測(cè)代謝物的波峰下面積及其與肌酸峰下面積比值。檢測(cè)的代謝物有：膽堿(choline，Cho)、乳酸(lactate，Lac)、谷氨酸-谷氨酰胺復(fù)合物(glumate+gultamine，Glx)、肌醇(inositol，Ins)、肌酸(creatine，Cr)。

1.3 標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)研究

BALB/c裸小鼠于磁共振檢查完畢后，向其腹腔注射10%水合氯醛處死，切開(kāi)裸鼠腫瘤部位皮膚，將腫瘤全部掏出，即放入無(wú)菌冰生理鹽水中，磁共振數(shù)據(jù)采集側(cè)腫瘤一分為二，一部分放入緩沖4%多聚甲醛，供石蠟包埋切片及細(xì)胞凋亡檢測(cè)；另一部分腫瘤組織放入液氮罐中，供Western blot檢測(cè)P-gp、MRP1、PKC、γ-GCSh、γ-GCSl、GSHS、GST蛋白表達(dá)。

HE染色結(jié)果分析：病理切片由兩位病理科醫(yī)師分別按同一標(biāo)準(zhǔn)在偏光顯微鏡下閱片分析，取兩位醫(yī)師所采集的均值為病理的檢測(cè)最終結(jié)果數(shù)值。

Western blot檢測(cè)由廣州杰特偉生物科技有限公司完成。所用抗體：羊抗小鼠IgG/HRP (Abclonal)，M D R 1(A 11 7 5 8，A b c l o n a l)；M R P 1(A 3 0 2 7，Abclonal)；PKC(A0267，Abclonal)；GST(2624S，CST)；GSS(A1069，Abclonal)；GCLM(A5314，Abclonal)；GCLC(Ab190685，Abcam)。所檢測(cè)代謝物膠片掃描入電腦，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Image J分析條帶凈光密度值，計(jì)算蛋白表達(dá)光密度比RIOD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組之間比較均采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，相關(guān)性分析均采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

耐藥組與非耐藥組分別有8個(gè)腫瘤最大徑線(xiàn)為1.5 cm以上。

2.1 腫瘤代謝物的1H-MRS檢測(cè)

腫瘤組織Cho、Lac、Glx、Ins與Cr峰量化結(jié)果見(jiàn)表1。耐藥組Cho峰、Lac峰、Glx1峰、Glx2峰面積及Ins/Cr峰面積比均較不耐藥組增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤1H-MRS檢測(cè)面積量化分析結(jié)果(±s)Tab.1 Results of quantit ative analysis of 1H-MRS measure area in drug-resistant tumor and drug- response tumor (±s)

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤1H-MRS檢測(cè)面積量化分析結(jié)果(±s)Tab.1 Results of quantit ative analysis of 1H-MRS measure area in drug-resistant tumor and drug- response tumor (±s)

組別 Cho Lac Ins/Cr Glx1 Glx2 Glx1/Cr Glx2/Cr不耐藥組(n=8) 0.94±0.47 0.60±0.14 1.42±0.26 1.38±0.10 0.64±0.21 2.35±0.34 1.18±0.39耐藥組(n=8) 2.89±0.92 1.92±0.29 3.99±0.96 2.88±0.62 0.90±0.35 5.36±0.36 1.75±0.53 Z值 2.611 2.611 2.611 1.964 2.193 1.091 1.358 P值 0.008 0.008 0.008 0.049 0.032 0.275 0.222

表2 SW480組與SW480/5-FU組蛋白表達(dá)RIOD值的比較(±s)Tab.2 Comparison of RIOD values of protein expression between SW480 and SW480/5-FU (±s)

表2 SW480組與SW480/5-FU組蛋白表達(dá)RIOD值的比較(±s)Tab.2 Comparison of RIOD values of protein expression between SW480 and SW480/5-FU (±s)

組別 p53 P-gp MRP1 PKC γ-GCSh γ-GCSl GSHS GST不耐藥組(n=8) 0.26±0.07 0.20±0.03 0.15±0.01 0.16±0.02 0.18±0.02 0.15±0.00 0.28±0.33 0.12±0.02耐藥組(n=8) 0.39±0.03 0.31±0.08 0.69±0.10 0.86±0.06 0.43±0.26 0.34±0.07 1.37±0.07 0.42±0.07 Z值 1.687 2.611 2.785 2.668 2.643 2.712 2.635 2.627 P值 0.095 0.003 0.005 0.008 0.008 0.007 0.008 0.008

圖1 荷瘤鼠腫瘤的T2WI橫斷位(A)、矢狀位(B)及冠狀位(C)成像 圖2 荷瘤鼠腫瘤的1H-MRS波譜曲線(xiàn)Fig. 1 T2WI transverse (A), sagittal (B) and coronal (C) imaging of tumors in tumor-bearing mice. Fig. 2 1H-MRS spectrum of tumors in tumor-bearing mice.

圖3 SW480組織切片(左)和SW480/5-FU組織切片(右)Fig. 3 SW480 tissue section (left) and SW480/5-FU tissue section (right).

2.2 腫瘤標(biāo)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

2.2.1 腫瘤組織的壞死

HE染色切片顯示SW480與SW480/5-FU腫瘤組織壞死區(qū)域范圍差距不明顯；SW480/5-FU細(xì)胞核較SW480大，并且細(xì)胞間排列更緊密，細(xì)胞密度較大(圖3)。

2.2.2 腫瘤組織蛋白表達(dá)(Western blot)檢測(cè)

耐藥組與不耐藥組P-g p、M R P 1、P K C、γ-GCSh、γ-GCSl、GSHS、GST蛋白表達(dá)情況見(jiàn)表2。耐藥組P-gp、MRP1、PKC、γ-GCSh、γ-GCSl、GSHS、GST表達(dá)量均較SW480組增加，兩組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

2.3 腫瘤組織1H-MRS檢測(cè)代謝物與腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的相關(guān)性

腫瘤Cho峰面積與腫瘤P-gp (r=0.636，P=0.048)、MRP1(r=0.821，P=0.004)、γ-GCSh (r=0.841，P=0.002)、γ-GCSl(r=0.799，P=0.006)表達(dá)呈正相關(guān)。腫瘤Lac峰面積與腫瘤P-gp (r=0.806，P=0.005)、γ-GCSh (r=0.730，P=0.017)表達(dá)呈正相關(guān)。腫瘤Ins/Cr面積比與腫瘤P-gp (r=0.770，P=0.009)、PKC (r=0.762，P=0.010)表達(dá)呈正相關(guān)。腫瘤Glx1面積與腫瘤MRP1(r=0.880，P=0.021)、GST (r=0.888，P=0.018)表達(dá)呈正相關(guān)。腫瘤Glx2面積與腫瘤MRP1(r=0.847，P=0.0 0 2)、γ-G C S h (r=0.6 4 4，P=0.0 4 4)、γ-GCShl(r=0.780，P=0.008)、GSHS (r=0.661，P=0.038)表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)早期無(wú)臨床癥狀，出現(xiàn)癥狀時(shí)，病變常已是中晚期，治療方法主要以5-氟尿嘧啶化療為主的綜合治療，但因?qū)熕幊霈F(xiàn)耐藥性，使結(jié)直腸癌的死亡率居高不下。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，死于不同程度的耐藥的腫瘤患者占90%。所以，及時(shí)檢測(cè)結(jié)腸癌耐藥性、調(diào)整治療方案已經(jīng)成為結(jié)直腸癌治療成功與否的關(guān)鍵因素[2-3]。

目前臨床和實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)腫瘤耐藥性的方法有CCK-8法、MTT法、ATP-TC法、流式細(xì)胞監(jiān)測(cè)和TECIA法等[4-5]，需要采集腫瘤組織標(biāo)本，難以用于臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)。腫瘤是一個(gè)分化不均質(zhì)、多形性細(xì)胞群體，這些方法僅能反映采集部位腫瘤組織的耐藥情況，不能準(zhǔn)確反映腫瘤整體的耐藥性。部分檢查方法需時(shí)較長(zhǎng)，腫瘤組織離開(kāi)體內(nèi)后某些生物代謝物可能發(fā)生變化，不能反映體內(nèi)腫瘤的真實(shí)情況。因此，探討便捷、可靠、能活體評(píng)價(jià)腫瘤耐藥性的方法顯得非常必要。

為探討上述問(wèn)題，本研究模擬臨床化療中的沖擊療法，對(duì)結(jié)腸癌SW480腫瘤細(xì)胞進(jìn)行大劑量沖擊，經(jīng)6個(gè)月的反復(fù)間斷在培養(yǎng)液中加入5-FU，獲得能夠在6 μg/mL 5-FU濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)的人類(lèi)結(jié)腸癌SW480耐藥細(xì)胞株，RI為4.44。用結(jié)腸癌SW480親本細(xì)胞和耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞SW480/5-5-FU制作的裸鼠移植瘤模型，后者的腫瘤組織細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1、PKC的表達(dá)明顯高于前者，說(shuō)明研究所獲得SW480/5-FU腫瘤組織對(duì)5-FU的耐藥性真實(shí)可靠。

人體組織的化合物在特定的條件下可產(chǎn)生化學(xué)位移，1H-MRS可采集這種位移所產(chǎn)生的峰值，并通過(guò)計(jì)算化合物共振峰的面積或峰高，對(duì)組織內(nèi)某種化合物的含量進(jìn)行量化分析[6]。1H-MRS是現(xiàn)今已用于臨床、可以活體檢測(cè)組織內(nèi)代謝物狀態(tài)的影像學(xué)方法，可以檢測(cè)體內(nèi)代謝活動(dòng)所導(dǎo)致的化合物的改變[6-10]。本研究使用1H-MRS活體檢測(cè)結(jié)腸癌SW480親本和5-FU耐藥的荷瘤鼠腫瘤組織代謝物Cho、Lac、Glx、Ins與Cr的改變情況，對(duì)比兩者代謝物變化的差異。

Cho峰位于3.21 ppm，成分包括膽堿、磷脂酰膽堿、磷酸膽堿類(lèi)等，反映被檢測(cè)組織內(nèi)總的膽堿含量，與磷脂代謝活動(dòng)密切相關(guān)，而磷脂雙分子層作為構(gòu)成細(xì)胞膜的基礎(chǔ)；測(cè)定Cho能間接反映組織細(xì)胞膜代謝的活躍程度[6-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，SW480/5-FU腫瘤組織中Cho面積較親本SW480腫瘤組織高，兩組之間存在顯著性差異(P＜0.05)；HE切片顯示SW480/5-FU腫瘤細(xì)胞密度明顯增高，細(xì)胞間隙縮?。荒[瘤Cho峰面積與腫瘤P-gp、MRP1、γ-GCSh、γ-GCSl等耐藥相關(guān)的基因及酶的表達(dá)呈正相關(guān)。推測(cè)可能隨著耐藥性的增長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞的代謝活動(dòng)進(jìn)一步活躍，細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)同時(shí)其合成、分解速率也可能加快，最終致使Cho的增加。

Cr波峰分別存在于3.02 ppm和3.94 ppm處，主要由肌酸和磷酸肌酸。人體三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)含量不足時(shí)，Cr通過(guò)釋放高能磷酸鍵的方式，使ATP能夠加速合成以供給能量，Cr的高低反映細(xì)胞能量代謝狀態(tài)。由于其體內(nèi)Cr的量在各類(lèi)病理生理情況下均相對(duì)穩(wěn)定，因此常將Cr峰作為參照物，評(píng)價(jià)其他各種代謝物的改變[6]。Ins波峰位于3.56 ppm處，是細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇的前體物質(zhì)，而磷脂酰肌醇是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一種途徑，參與肌醇-三磷酸循環(huán)[6]；它是一種與細(xì)胞膜的更新和細(xì)胞磷脂層結(jié)構(gòu)有關(guān)的物質(zhì)，因此任何一種形式的細(xì)胞膜更新的加快或細(xì)胞膜磷脂層的破壞都可以導(dǎo)致Ins濃度的升高[11]。Ins常參與PKC的激活，而PKC對(duì)腫瘤的侵襲性有調(diào)節(jié)作用，是耐藥相關(guān)蛋白。研究表明惡性度高或侵襲性強(qiáng)的原發(fā)性腦腫瘤內(nèi)可發(fā)現(xiàn)PKC增高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，SW480/5-FU組與親本SW480/腫瘤組織比較，Ins/Cr面積明顯增高(P＜0.05)，PKC蛋白表達(dá)明顯增多；腫瘤Ins/Cr面積比與腫瘤P-gp、PKC表達(dá)呈正相關(guān)。這說(shuō)明MRS活體監(jiān)測(cè)Ins/Cr的變化可能作為活體檢測(cè)腫瘤耐藥性的分子標(biāo)志物。

Lac峰出現(xiàn)在1.33 ppm，由于雙自旋作用，表現(xiàn)為雙尖峰。正常組織一般情況下不出現(xiàn)Lac峰，但在一些情況，如缺血缺氧、炎癥、代謝性異常等狀態(tài)下，可產(chǎn)生大量的乳酸產(chǎn)物而出現(xiàn)Lac峰[6，8]。腫瘤組織代謝旺盛，并且即使在有氧環(huán)境下仍然持續(xù)的發(fā)生糖酵解反應(yīng)，最終生成大量代謝產(chǎn)物乳酸。而乳酸的聚集與腫瘤多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)存在密切關(guān)系，因臨床大多數(shù)化療藥物呈弱堿性，大量的乳酸所電離出的氫離子能中和藥物中的氫氧根離子，使其不易穿透細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致腫瘤MDR[13]。此外，腫瘤酸化耐藥機(jī)制還可能與P-gp有關(guān)，Thews等[10]把前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于酸性培養(yǎng)基數(shù)小時(shí)以后，結(jié)果顯示P-gp活性加倍，但表達(dá)不變，提示酸性條件能誘導(dǎo)P-gp產(chǎn)生更高傳輸速率。本研究結(jié)果顯示，SW480/5-FU組織中的Lac峰面積明顯高于不耐藥的SW480；腫瘤Lac峰面積與腫瘤P-gp、γ-GCSh表達(dá)呈正相關(guān)。因此，Lac的變化能從活體組織酸堿度的層面作為評(píng)價(jià)腫瘤耐藥性的分子標(biāo)志物。

Glx峰位于2.1～2.4 ppm及3.65～3.8 ppm處，包括谷氨酸和谷氨酰胺，由于兩者存在復(fù)合重疊的J偶聯(lián)共振，常難以區(qū)分開(kāi)[6，8，14]。Glx作為谷胱甘肽(glutathione，r-glutamyl cysteingl+glycine，GSH)的前體物質(zhì)，參與了細(xì)胞氧化還原平衡的調(diào)節(jié)，Glx峰的增高常見(jiàn)于組織嚴(yán)重缺氧狀態(tài)[6，8，14]。大量研究證實(shí)GSH的增加能使腫瘤細(xì)胞抵抗來(lái)自放療或化療的自由基損傷，導(dǎo)致腫瘤耐藥[15]。本研究發(fā)現(xiàn)與不耐藥組結(jié)腸癌移植瘤相比，耐藥組移植瘤的Glx1、Glx2峰面積更高，兩者之間存在顯著性差異(P＜0.05)；腫瘤Glx1面積與腫瘤MRP1、GST表達(dá)呈正相關(guān)，腫瘤Glx2面積與腫瘤MRP1、γ-GCSh、γ-GCShl、GSHS表達(dá)呈正相關(guān)。可見(jiàn)Glx1、Glx2峰可以反映腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)的谷胱甘肽代謝狀態(tài)，可能成為活體監(jiān)測(cè)腫瘤耐藥性的生物標(biāo)志物。

本研究尚存在不足：本研究?jī)H觀察一種耐藥程度SW480/5-FU (RI為4.44)的活體監(jiān)測(cè)情況，下一步將繼續(xù)培養(yǎng)不同耐藥程度的結(jié)腸癌細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察不同耐藥性的磁共振參數(shù)變化，以觀察相應(yīng)代謝物與耐藥相關(guān)性的穩(wěn)定性和重復(fù)性。此外，本研究樣本量較小(n=5)，尚需擴(kuò)大樣本量重復(fù)實(shí)驗(yàn)研究，研究腫瘤體積較小，結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜，固定體素的大小限制使其難以完全排除部分容積效應(yīng)，可能對(duì)結(jié)果有一定的影響。

綜上所述，1H-MRS檢測(cè)代謝物中，耐藥組移植瘤Cho、Lac、Glx1、Glx2面積及Ins/Cr面積比明顯高于不耐藥組移植瘤，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。因此，1H-MRS通過(guò)檢測(cè)的腫瘤內(nèi)代謝物變化，有可能對(duì)活體評(píng)價(jià)結(jié)腸癌耐藥與否具有重要意義。

利益沖突：無(wú)。