共生細(xì)菌對(duì)鹽生小球藻亞砷酸鹽代謝的影響

王亞茹,潘 曉,于清男,張春華,葛 瀅

共生細(xì)菌對(duì)鹽生小球藻亞砷酸鹽代謝的影響

王亞茹1,潘 曉1,于清男1,張春華2*,葛 瀅1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,元素與生命科學(xué)示范實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

為探討共生細(xì)菌對(duì)鹽生小球藻()亞砷酸鹽(As(III))富集和形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響,從培養(yǎng)液中分離培養(yǎng)出一株共生細(xì)菌,并采用抗生素處理獲得無菌藻,設(shè)置0,75,150,300,750 μg/LAs(III)溶液處理帶菌和無菌的,7d后測(cè)定對(duì)As(III)的吸收、吸附和富集量,以及培養(yǎng)液和藻細(xì)胞內(nèi)As的形態(tài),計(jì)算帶菌和無菌對(duì)As(III)的氧化率和去除率;使用不同濃度的As(III)處理共生細(xì)菌7d,并以300μg/L的As(III)處理共生細(xì)菌不同時(shí)間,計(jì)算兩種情況下共生細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)液中As(III)的氧化率和去除率.結(jié)果表明:的共生細(xì)菌為根癌農(nóng)桿菌(WB-1);與無菌相比,帶菌生長(zhǎng)更快、對(duì)As(III)的耐性更強(qiáng).帶菌對(duì)As(III)的富集量為103.10~448.12mg/kg、氧化率為78.93%~96.88%、去除率為18.92%~55.21%,顯著高于無菌的富集量(11.68~91.39mg/kg)、氧化率(14.46%~26.39%)和去除率(12.82%~29.15%),也高于WB-1對(duì)As(III)的氧化率(4.51%~30.61%)和去除率(1.86%~16.19%).此外,帶菌胞內(nèi)還檢測(cè)到少量的As(III)和甲基砷,而在無菌胞內(nèi)沒有甲基砷存在.共生細(xì)菌促進(jìn)了鹽生小球藻對(duì)As(III)的富集和形態(tài)轉(zhuǎn)化.

共生細(xì)菌；鹽生小球藻；亞砷酸鹽；富集；形態(tài)轉(zhuǎn)化

近年來,人類活動(dòng)(采礦、冶煉、工業(yè)等)導(dǎo)致砷污染狀況日益嚴(yán)重,砷中毒事件頻發(fā),嚴(yán)重危害了人體健康.砷在自然水體中主要以亞砷酸鹽(As(III))和砷酸鹽(As(V))形式存在.一般情況下,As(III)的毒性大于As(V)[1-3],且在自然水體中As(III)反應(yīng)活性較高,結(jié)合吸附能力較弱,很難被固定化,難以去除;而As(V)容易被吸附,且毒性相對(duì)較小.因此砷污染修復(fù)的關(guān)鍵步驟之一,就是將水體中As(III)氧化為As(V),從而減少砷的毒性以及其在環(huán)境中的移動(dòng)性[4-5].

微藻是一類單細(xì)胞生物,比表面積較大[6],對(duì)砷具有一定的富集功能[7],能將As(III)氧化成As(V)[8-9],從而達(dá)到砷污染修復(fù)的目的.例如,張兵等[10]和Yin等[11]使用不同濃度的As(III)處理集胞藻(sp. PCC6803)后,發(fā)現(xiàn)集胞藻細(xì)胞中砷形態(tài)以As(V)為主,占總砷濃度的81%~85%,其余為As(III).As(III)被氧化為As(V),降低了砷對(duì)微藻細(xì)胞的毒害,但微藻對(duì)As(III)的氧化機(jī)制仍不清楚.鹽生小球藻()屬于綠藻門,在海水中分布廣泛,對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng).Murray等[12]和Levy等[13]利用不同濃度As(V)處理鹽生小球藻3d后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)的砷以As(V)為主要形態(tài),As(III)所占比例為1%~6%,砷酸鹽的還原率比較低.Karadjova等[14]的研究同樣得到類似的結(jié)果,但是該藻對(duì)As(III)的富集和代謝特點(diǎn)還研究較少.

在自然水體中,微藻常與細(xì)菌形成藻菌共生體[15],藻菌共生體對(duì)水體中重金屬污染物生物富集具有重要作用.藻菌共生系統(tǒng)在污水凈化領(lǐng)域已受到廣泛關(guān)注.當(dāng)共生細(xì)菌存在時(shí)能夠通過多種途徑降低重金屬對(duì)微藻的毒性,例如促進(jìn)微藻表面分泌物的分泌,增加微藻表面積,以此增加微藻對(duì)重金屬的表面吸附,抑制重金屬向微藻胞內(nèi)擴(kuò)散,減少重金屬對(duì)微藻毒性等[16].廖敏等[17]發(fā)現(xiàn)有些微藻類生物相互粘接交聯(lián)后經(jīng)細(xì)菌作用在表面形成的一種類似于活性污泥的可絮凝結(jié)構(gòu)—菌藻生物膜,對(duì)As(III)和As(V)的去除率都高達(dá)80%以上;許平平等[18]研究發(fā)現(xiàn)鹽生小球藻與鹽單胞菌形成的共生系統(tǒng)能夠還原As(V)為As(III),共生細(xì)菌的存在顯著增加了對(duì)As(V)的去除率,且出現(xiàn)甲基砷,說明了共生細(xì)菌影響了對(duì)As(V)的代謝;王亞等[8]發(fā)現(xiàn),共生細(xì)菌麥?zhǔn)辖惶鎲伟?WY01)可以促進(jìn)鹽藻對(duì)As(III)的氧化,然而Duncan 等[19]發(fā)現(xiàn)有些共生細(xì)菌如弧菌(sp.)、粘球菌(sp.)等不會(huì)影響鹽藻對(duì)As(III)的形態(tài)轉(zhuǎn)化.目前,關(guān)于共生細(xì)菌對(duì)微藻As(III)富集和形態(tài)變化的影響并沒有作出明確的結(jié)論,這說明共生細(xì)菌對(duì)微藻As(III)代謝的影響還需要進(jìn)一步研究.

本研究從培養(yǎng)液中分離得到一株共生細(xì)菌,經(jīng)鑒定為根癌農(nóng)桿菌(WB-1),以不同濃度As(III)溶液分別處理帶菌和無菌以及WB-1,探討共生細(xì)菌對(duì)亞砷酸鹽的吸附、吸收和形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響,以期為水體砷污染修復(fù)技術(shù)開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

1.1.1的來源與培養(yǎng)條件 鹽生小球藻()購(gòu)自山東青島中國(guó)科學(xué)院海洋生物種質(zhì)庫(kù),培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基,加入20mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)調(diào)節(jié)pH值為8.00± 0.02,121℃高壓蒸汽滅菌20min;光照明暗比12h:12h,光照強(qiáng)度3500~4000lx,培養(yǎng)溫度(25±1)℃[18].

1.1.2 無菌的獲取和檢驗(yàn) 為獲得無菌,向帶菌中加入組合抗生素(新霉素、氨芐青霉素和硫酸卡那霉素)母液,最終濃度分別為400mg/L,100mg/L,100mg/L,連續(xù)處理3次,每次間隔2d,培養(yǎng)1~2代以消除抗生素對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生的不良影響.使用LB固體平板涂布法檢測(cè)除菌效果,若平板上無菌落出現(xiàn),則認(rèn)為該可作為無菌狀態(tài)進(jìn)行試驗(yàn).

1.1.3共生細(xì)菌的來源與培養(yǎng)條件 根癌農(nóng)桿菌(WB-1)是從培養(yǎng)液中分離出來的共生細(xì)菌,具體鑒定方法參照1.2.1.共生細(xì)菌的分離、純化使用LB培養(yǎng)基,在亞砷酸鹽試驗(yàn)中使用f/2培養(yǎng)基,加入10g/L的葡萄糖以確保細(xì)菌碳源的供應(yīng),pH值為8.00±0.02,121℃高壓蒸汽滅菌20min,細(xì)菌于30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為180r/ min.

1.2 研究方法

1.2.1共生細(xì)菌的分離、培養(yǎng)、鑒定 使用平板涂布法在的培養(yǎng)液中分離細(xì)菌,30℃恒溫條件下培養(yǎng)72h,只觀察到一種菌落形態(tài).使用平板劃線法在固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行多次純化,通過在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征,確定該菌株為純培養(yǎng)物.挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基,使用恒溫?fù)u床活化培養(yǎng).

共生細(xì)菌通過16S rRNA序列測(cè)定進(jìn)行鑒定.使用試劑盒( TIANamp Bacteria DNA Kit) 提取細(xì)菌基因組DNA,按照說明書操作步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所用引物為細(xì)菌通用引物為:27F (5'-AGAGTTTG- ATCCTGGCTCAG-3')和1492Ｒ(5'-GGTTACCTT- GTTACGACTT-3')(Weisburg等[20]).擴(kuò)增條件為: 95℃預(yù)變性10min、95℃變性45s、50℃退火45s、72℃延伸240s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,結(jié)果顯示產(chǎn)物全長(zhǎng)約為2.0kbp,說明擴(kuò)增產(chǎn)物符合要求.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行DNA片段測(cè)序.將獲得序列與NCBI上已有序列進(jìn)行Blast比對(duì),獲得相似性高的細(xì)菌種屬.選取有代表性的菌株,使用MEGA 6.0軟件的鄰接法(Neighbor Joining Method)構(gòu)建共生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(步長(zhǎng)值為1000).對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)分析和生理生化試驗(yàn),并與細(xì)菌伯杰氏手冊(cè)(第八冊(cè))作對(duì)比.

1.2.2 As(III)和共生細(xì)菌對(duì)生長(zhǎng)影響 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的接種到已滅菌的加入不同濃度As(III)的f/2培養(yǎng)基中,培養(yǎng)體系為100mL,培養(yǎng)的初始OD為0.16±0.02(細(xì)胞密度為9.28×105cells/mL),每天定時(shí)搖勻3次,測(cè)定OD值觀察每天的生長(zhǎng)量.選取加入75μg/LAs(III)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期的帶菌和無菌進(jìn)行掃描電鏡(scanning electronic microscopy, SEM) (日立SU8010)觀察,以不加As(III)的帶菌和無菌做空白對(duì)照,觀察As(III)對(duì)細(xì)胞表面形態(tài)的影響,具體試驗(yàn)步驟如下:將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的離心(8000r/min,5min)棄上清液,然后用35‰的氯化鈉溶液清洗2~3次,最后用2.50%的戊二醛固定到離心管中.樣品經(jīng)脫水、干燥,噴金鍍膜,制片后用SEM進(jìn)行拍照觀察.

選取若干干燥塑料離心管進(jìn)行編號(hào)稱重.收取不同濃度As(III)處理7d后的藻樣,于-60℃冰箱低溫冷凍24h后進(jìn)行冷凍干燥(24h),利用差減法得到帶菌和無菌藻細(xì)胞的干重.同時(shí)在試驗(yàn)過程中將3個(gè)未加的空白離心管進(jìn)行同批次冷凍干燥,以避免操作過程中水分、溫度等非生物因素對(duì)干重的影響.

1.2.3對(duì)As(III)的富集、吸附、吸收和形態(tài)轉(zhuǎn)化 將帶菌和無菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期后換至已滅菌的新鮮f/2培養(yǎng)基中,于250mL錐形瓶分裝100mL藻液,試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)As(III)濃度,分別為75,150,300,750μg/L,每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù).同時(shí),設(shè)置不加砷的對(duì)照處理和不加藻液的新鮮f/2培養(yǎng)液(試劑空白),7天后獲取培養(yǎng)液,檢測(cè)其中砷形態(tài).將無菌和帶菌置于25℃下培養(yǎng)7d后收取藻樣,藻液在8000/min離心10min,收集上清液用于測(cè)定培養(yǎng)液中As含量和形態(tài),收集藻細(xì)胞將其冷凍干燥后測(cè)定砷富集量和磷含量.以同樣的方式收集藻細(xì)胞,藻細(xì)胞用1mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS,含5mmol/LMES,1mmol/L K2HPO4、和0.5mmol/LCa(NO3)2, 35‰的鹽度以保證滲透壓平衡和細(xì)胞完整),搖散后靜置10min,離心收集藻細(xì)胞,重復(fù)洗滌兩次后[8,18,21],冷凍干燥測(cè)定胞內(nèi)砷含量、形態(tài).藻細(xì)胞砷吸附量為砷富集量減去胞內(nèi)吸收量.

1.2.4細(xì)胞砷總量和磷含量的測(cè)定 稱取約0.01g的冷凍干燥后的藻樣至消煮管中,加入2mL混酸(HNO3:HClO4,4:1),封口,充分震蕩后靜置過夜,然后電熱消解(Hanon SH230消解儀,120±2℃).使用氫化物發(fā)生-雙道原子熒光光度計(jì)(HG-AFS,北京吉天AFS-9130)測(cè)定藻樣中總砷含量;總磷含量使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES,Perkin Emler Optima 8000)進(jìn)行測(cè)定.總砷、總磷含量的測(cè)定使用米粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)米粉(NIST-SRM 1568b)進(jìn)行檢驗(yàn),并以同批次加As(III)的f/2培養(yǎng)液為空白進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),回收率為96.86%~105.38%.米粉總砷和總磷回收率分別為111.48%和95.69%,說明樣品消解方法可靠.

1.2.5胞內(nèi)及培養(yǎng)液砷形態(tài)的測(cè)定 稱取約0.01g冷凍干燥的藻樣于10mL的離心管中,加入2mL 1.75%的HNO3,90℃超聲10min[18],再置于離心機(jī)中10000離心10min,收集上清液.重復(fù)提取3次,合并上清液.在測(cè)定前,將藻樣提取液和培養(yǎng)液樣品過0.22μm水系濾膜,同時(shí)配制含有一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、As(V)、As(III)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光度計(jì)(HPLC-HG-AFS,北京吉天SA-10)進(jìn)行測(cè)定.

1.2.6 共生細(xì)菌對(duì)As(III)的形態(tài)轉(zhuǎn)化 將根癌農(nóng)桿菌(WB-1)于LB固體培養(yǎng)基劃線,在30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,勾取單菌落于f/2培養(yǎng)基(加入10g/L葡萄糖,下同),在30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng),溫度為30℃,轉(zhuǎn)速為180r/min,培養(yǎng)48h,將細(xì)菌懸浮液離心、清洗后接種到20mL滅菌的f/2培養(yǎng)基中,細(xì)菌懸浮液初始OD600為0.04,As(III)處理濃度分別為0,75,150,300,750μg/L,處理時(shí)間為7d,10000離心5min,收取上清液,使用HPLC- HG-AFS測(cè)定培養(yǎng)液砷的形態(tài).此外,使用300μg/LAs(III)處理共生細(xì)菌,測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72h)下培養(yǎng)液砷形態(tài)及含量.

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖,并采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析(<0.05).試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(=3)

2 結(jié)果與討論

2.1 共生細(xì)菌的分離與鑒定

利用平板劃線法在的培養(yǎng)液中分離并純化出一株細(xì)菌,通過16S rRNA序列測(cè)定,得到的基因序列與NCBI核苷酸序列Blast比對(duì)后,結(jié)果顯示該菌株與根癌農(nóng)桿菌相似性為100%,基于16S rRNA基因序列,對(duì)菌株WB-1構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示,將細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)(表1)與細(xì)菌伯杰氏手冊(cè)(第八版)[22]對(duì)比,表1數(shù)據(jù)與根癌農(nóng)桿菌()的生理數(shù)據(jù)一致,從而確定該共生細(xì)菌為根癌農(nóng)桿菌,為表述簡(jiǎn)便,下文中簡(jiǎn)稱WB-1.

表1 細(xì)菌A .tumefaciens WB-1形狀及基本理化特征

注:“+”陽性反應(yīng),“－”陰性反應(yīng).

圖1 菌株A. tumefaciens WB-1基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

節(jié)點(diǎn)處表示鄰接數(shù)據(jù)集基于1000次重復(fù)的步長(zhǎng)值,標(biāo)尺表示1616S rRNA序列5%的差異

2.2 As(III)和共生細(xì)菌對(duì)C. salina生長(zhǎng)的影響

2.2.1 As(III)和共生細(xì)菌對(duì)生長(zhǎng)的OD值和干重的影響 無論是在浮游狀態(tài)共生還是在生物膜中共生,藻類與細(xì)菌之間的相互作用都可能改變?cè)孱悓?duì)污染物的敏感性[13].藻菌共生系統(tǒng)中細(xì)菌促進(jìn)微藻生長(zhǎng)主要有3種方式:提供生長(zhǎng)要素和轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)因子、釋放信息素和減少有毒物質(zhì)的侵害[23].研究表明,有些細(xì)菌如黃曲霉菌(AB402)和芽孢桿菌(AB403)能夠分泌植物生長(zhǎng)激素IAA,促進(jìn)植物生長(zhǎng)[24],同時(shí)鹽單胞菌(sp. Cs1)與共生時(shí),增加了對(duì)砷的吸附,從而減少對(duì)砷的吸收,減少砷對(duì)的毒性,促進(jìn)微藻繁殖[18].如圖2所示,不同濃度的As(III)處理下,與空白對(duì)比,As(III)顯著抑制了無菌的生長(zhǎng)(< 0.05,圖2a),但對(duì)帶菌的生長(zhǎng)沒有顯著影響(圖2b),說明共生細(xì)菌降低了As(III)對(duì)鹽生小球藻的毒性.無論是否加As(III),無菌的OD值(圖2a)和生物量(表2)都比帶菌(圖2b,表2)的低,說明共生細(xì)菌促進(jìn)了的生長(zhǎng),這可能與共生細(xì)菌能夠分泌IAA,促進(jìn)鹽生小球藻的生長(zhǎng)有關(guān).但是無論是無菌還是帶菌,當(dāng)用不同濃度的As(III)處理時(shí)干重都沒有顯著性差異,說明75~750μg/L的As(III)不會(huì)對(duì)的干重產(chǎn)生明顯影響.

表2 帶菌和無菌C. salina不同濃度As(III)暴露7d后的生物量

注:生物量均以100mL藻液干重計(jì);不同字母表示處理之間差異顯著(<0.05,LSD);大寫字母表示無菌小球藻和帶菌小球藻的比較,小寫字母表示不同As(III)濃度之間的比較.

圖3 75 μg/LAs(III)溶液處理C. salina 7d后細(xì)胞的SEM圖像(′30000)

2.2.2 As(III)和共生細(xì)菌對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 Levy等[25]在72h毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與無菌小球藻相比,共生細(xì)菌存在時(shí)可顯著降低Cu對(duì)小球藻的毒性,原因是共生細(xì)菌促進(jìn)了小球藻EPS的分泌,對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行了保護(hù).本研究發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,帶菌小球藻在電鏡下觀察到大量胞外聚合物(EPS),形成了微藻團(tuán)聚體(圖3b),而無菌小球藻分泌的胞外聚合物相對(duì)較少(圖3a).在75μg/L的As(III)處理下,的形態(tài)都發(fā)生了變化,帶菌小球藻細(xì)胞有明顯褶皺、變長(zhǎng)(圖3d),且無菌比帶菌變形嚴(yán)重,無菌細(xì)胞中間出現(xiàn)嚴(yán)重凹陷(圖3c),這是因?yàn)楣采?xì)菌的存在增加了鹽生小球藻胞外聚合物的釋放,將單個(gè)微藻細(xì)胞緊密聯(lián)結(jié)在一起,形成大的微藻團(tuán)聚體,在藻細(xì)胞表面形成一種天然屏障,使得增多的砷吸附在微藻表面,減少進(jìn)入微藻細(xì)胞中的砷,以此降低亞砷酸鹽對(duì)的毒性.

2.3 無菌和帶菌C. salina對(duì)As(III)的富集、吸收、吸附和形態(tài)轉(zhuǎn)化

2.3.1對(duì)As(III)的富集、吸收和吸附 菌藻共生體對(duì)水體砷污染的修復(fù)是細(xì)菌和微藻共同作用的結(jié)果,微藻在利用水體中氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽的同時(shí),可能會(huì)通過氮、磷吸收途徑富集水體中的砷,達(dá)到去除水體中砷的目的[26].隨著As(III)處理濃度的增加,無菌和帶菌對(duì)砷的吸收量、吸附量及富集量均顯著增加(<0.05)(表3).不同濃度的As(III)溶液處理下,帶菌對(duì)砷的吸附量為46.80~ 252.49mg/kg,占總砷富集含量45.38%~56.34%,顯著高于無菌對(duì)砷的吸附量(5.30~38.30mg/kg),表明共生細(xì)菌的存在有利于對(duì)砷的吸附.在75~750μg/LAs(III)處理7d后,無菌吸收的砷為6.38~53.09mg/kg,占總砷富集量的54.62%~ 71.58%,而帶菌吸收的砷為56.31~ 195.64mg/kg,占45.38%~56.34%,表明共生細(xì)菌減少了微藻對(duì)砷的吸收比例,從而降低了砷對(duì)微藻細(xì)胞的毒性.

表3 不同濃度As(III)處理7d后無菌和帶菌C. salina吸收、吸附和富集砷的含量及比例

注:不同字母表示處理之間差異顯著(<0.05, LSD);nd表示未檢出或低于方法檢出限;大寫字母表示無菌小球藻和帶菌的比較,小寫字母表示不同As(III)處理之間的比較.

與空白相比,75μg/L As(III)溶液處理顯著降低了帶菌藻細(xì)胞中的磷含量,隨著As(III)處理濃度的增加,不同處理中帶菌細(xì)胞內(nèi)磷含量并沒有顯著變化(表4).隨著As(III)處理濃度的增加,帶菌對(duì)砷的胞內(nèi)吸收比例顯著下降,同時(shí)除了75 μg/L的As(III)溶液處理,其余濃度的As(III)溶液處理下,帶菌胞內(nèi)磷含量顯著高于無菌胞內(nèi)磷含量,這主要是因?yàn)锳s(V)與磷酸鹽化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,As(V)通過磷酸鹽通道進(jìn)入微藻細(xì)胞,胞內(nèi)磷與As(V)形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,因此阻擋了As(V)進(jìn)入藻細(xì)胞[27-28].隨著胞內(nèi)砷含量的降低和胞內(nèi)磷含量的增加,微藻胞內(nèi)As/P降低,As(V)對(duì)藻細(xì)胞的毒性減小.藻細(xì)胞吸附增加,可能是由于帶菌細(xì)胞之間粘合性緊密,表面積相對(duì)增加,從而增加了As(V)結(jié)合位點(diǎn),使得As(III)氧化后的As(V)更多的吸附在胞外,從而降低了砷毒性,減少砷對(duì)小球藻生長(zhǎng)的抑制,不同濃度As(III)溶液處理無菌和帶菌7d后,溶液中砷的去除率隨As(III)處理濃度的增加呈降低的趨勢(shì)(表5).無菌對(duì)砷的去除率為12.82%~27.43%,低于帶菌對(duì)砷的去除率(18.92%~55.21%).與富集砷的規(guī)律相符合(表3),這與許平平等[18]研究結(jié)果一致,當(dāng)使用不同濃度的As(V)處理帶菌和無菌的時(shí),帶菌小球藻砷吸附量顯著高于無菌,這與帶菌條件下分泌的EPS多,增加了藻細(xì)胞表面砷的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān).因此與細(xì)菌共生能夠大大提高培養(yǎng)液中砷的去除率.

表4 不同濃度As(III)處理7d后無菌和帶菌小球藻細(xì)胞磷含量

注:不同字母表示處理之間差異顯著(<0.05, LSD);大寫字母表示無菌和帶菌的比較,小寫字母表示不同As(III)濃度之間的比較.

表5 不同濃度As(III)處理7d后無菌和帶菌C. salina培養(yǎng)液砷含量及去除率

注:不同字母表示處理之間差異顯著(<0.05, LSD);nd表示未檢出或低于方法檢出限;大寫字母表示無菌和帶菌的比較,小寫字母表示不同As(III)處理濃度之間的比較.

2.3.2胞內(nèi)及培養(yǎng)液砷形態(tài)及含量 經(jīng)檢測(cè),空白培養(yǎng)液內(nèi)砷主要以As(III)形態(tài)存在,As(V)只占砷總量的1.83%~5.22%,說明培養(yǎng)體系中As(III)形態(tài)穩(wěn)定.由圖4(a)可知,不同濃度As(III)處理7d后,無菌細(xì)胞內(nèi)砷以As(III)和As(V)為主要形態(tài),As(III)占胞內(nèi)砷含量的41.70%~55.34%,As(V)占總砷含量的44.66%~58.30%,且沒有檢測(cè)到DMA和MMA等甲基砷形態(tài);而帶菌細(xì)胞中As(V)為主要形態(tài),As(V)占胞內(nèi)砷總量的95.68%~97.86%,但檢測(cè)到了少量的DMA和MMA(0.33~2.15mg/kg),約占胞內(nèi)砷含量的0.15%~0.97%(圖4(b)).由圖5 (a)可知,在不同濃度As(III)溶液處理無菌和帶菌,7d后發(fā)現(xiàn)無菌培養(yǎng)液中砷仍以As(III)為主要形態(tài),占總砷含量的73.61%~84.34%.除75μg/L處理濃度外,其他處理培養(yǎng)液中均存在DMA,占總砷含量的7.69%~12.68%,無MMA出現(xiàn),As(V)占培養(yǎng)液總砷比例為14.46%~26.39%.不同濃度As(III)處理帶菌7d后,其培養(yǎng)液以As(V)為主要形態(tài)(圖5 (b)),占培養(yǎng)液砷總量的78.93%~96.88%,此外還檢測(cè)到少量As(III)、DMA和MMA,這說明共生細(xì)菌影響了對(duì)As(III)的氧化和甲基化.Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻對(duì)As(III)的氧化是由胞內(nèi)、胞外共同作用,且以胞外氧化為主,Yin等[11]和Wang等[30]也得到類似結(jié)果,微藻細(xì)胞對(duì)As(III)的氧化主要發(fā)生在細(xì)胞表面,且與微藻細(xì)胞表面分泌的多種酶類物質(zhì)(如碳酸酐酶和胞外磷酸酶等)密切相關(guān).當(dāng)共生細(xì)菌存在時(shí),對(duì)As(III)的氧化率明顯高于無菌(<0.05),且As(III)的氧化可能發(fā)生在胞內(nèi),微藻細(xì)胞將As(III)吸收,在胞內(nèi)被氧化成As(V),然后通過磷酸鹽通道外排到胞外;也可能發(fā)生在胞外,由細(xì)胞分泌的某種物質(zhì)將As(III)氧化成As(V),As(V)通過磷酸鹽通道進(jìn)入胞內(nèi),As(III)的氧化反應(yīng)是在的胞內(nèi)還是胞外還需要更深入的研究.共生細(xì)菌存在可以減少砷對(duì)小球藻的毒性,其可能的原因有三個(gè):一是該菌存在時(shí)微藻細(xì)胞對(duì)As(III)吸收減少,從而減少As(III)對(duì)微藻毒性(表3);二是該菌存在使得分泌大量EPS,形成一種天然屏障,對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)(圖3);三是當(dāng)共生細(xì)菌存在時(shí),加入的As(III)絕大部分被氧化成了As(V),降低了As(III)對(duì)微藻細(xì)胞的毒性(圖4,5).綜上,共生細(xì)菌可以通過提高對(duì)亞砷酸鹽的氧化來降低砷的毒性,也能增加鹽生小球藻對(duì)水體中砷的富集來提高對(duì)砷的去除效果,為藻菌共生體系在水體砷污染修復(fù)上的應(yīng)用提供了依據(jù).

圖4 不同濃度As(III)處理7d后無菌和帶菌C. salina細(xì)胞內(nèi)的砷形態(tài)及含量

圖5 不同濃度As(III)處理7d后無菌和帶菌C. salina培養(yǎng)液砷形態(tài)及含量

2.4 共生細(xì)菌對(duì)As(III)的形態(tài)轉(zhuǎn)化

細(xì)菌對(duì)砷的生物轉(zhuǎn)化主要是通過氧化-還原,甲基化-去甲基化等化學(xué)作用改變砷的形態(tài),從而影響砷的生物有效性,達(dá)到降低環(huán)境中砷毒性的目的[31].使用不同濃度的As(III)處理根癌農(nóng)桿菌WB-1,如圖6(a)所示細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)液砷濃度為66.15~702.96μg/L,對(duì)砷的去除率為1.86%~16.19%,低于帶菌的去除率.不同濃度As(III)處理下,細(xì)菌培養(yǎng)液中砷以As(III)為主(65.98%~84.12%),其余為As(V),未檢測(cè)到甲基砷,表明該細(xì)菌對(duì)As(III)的氧化能力較弱,7d內(nèi)不存在砷的甲基化過程.在300μg/L的As(III)處理下,該細(xì)菌對(duì)As(III)有一定的氧化能力,其氧化率為4.51%~ 30.61%;培養(yǎng)液中未檢測(cè)到甲基砷的存在,說明該細(xì)菌對(duì)As(III)沒有甲基化過程(圖6(b)).Shi等[32]使用1mmol/L As(III)處理根癌農(nóng)桿菌(GW4),發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌對(duì)As(III)的氧化能力可達(dá)7.0mmol/g,其在試驗(yàn)中構(gòu)建一株去除亞砷酸鹽氧化基因AioR基因的突變體菌株GW4-ΔAioR,該細(xì)菌的亞砷酸鹽氧化率降低50%,說明AioR基因在亞砷酸鹽的氧化過程中起到氧化過程中起到重要作用.有研究發(fā)現(xiàn),根癌農(nóng)桿菌(GW4)和(A5)都是亞砷酸鹽氧化細(xì)菌,氧化酶AioAB是主導(dǎo)As(III)氧化的關(guān)鍵原因[33-34].本試驗(yàn)中使用不同濃度的As(III)單獨(dú)培養(yǎng)該細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌具有一定的氧化能力.當(dāng)使用300μg/L As(III)在不同時(shí)間單獨(dú)處理該細(xì)菌時(shí),1h之前,細(xì)菌處于生長(zhǎng)初期,對(duì)As(III)的氧化不明顯, 1~2h對(duì)As(III)氧化速率大大提升,達(dá)到最高氧化率30.61%,此后在24h內(nèi)一直保持穩(wěn)定,24~48h有一個(gè)還原過程,將培養(yǎng)液內(nèi)的As(V)還原成As(III),這說明該細(xì)菌是一個(gè)氧化還原菌,既能氧化亞砷酸鹽,又能還原砷酸鹽.

3 結(jié)論

3.1 不同濃度的As(III)處理時(shí),共生細(xì)菌的存在顯著促進(jìn)了的生長(zhǎng),降低了As(III)對(duì)微藻細(xì)胞的毒性.

3.2 帶菌對(duì)水體中As(III)的去除率為18.92%~55.21%,顯著高于無菌的去除率(12.82%~27.43%),以及共生細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的去除率(1.86%~16.19%),說明共生細(xì)菌的存在有利于水體中As(III)的去除.

3.3 共生細(xì)菌的存在能夠促進(jìn)對(duì)As(III)的氧化,當(dāng)共生細(xì)菌存在時(shí),培養(yǎng)液內(nèi)砷以As(V)為主,氧化率高達(dá)78.93%~96.88%,顯著高于無菌和共生細(xì)菌對(duì)As(III)的氧化率,表明藻菌共生有利于As(III)的氧化,從而降低砷毒性.

3.4 共生細(xì)菌存在時(shí),培養(yǎng)液以及胞內(nèi)有少量甲基砷的出現(xiàn),而無菌小球藻胞內(nèi)和共生細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)都沒有甲基砷出現(xiàn),說明共生細(xì)菌促進(jìn)了的甲基化,影響了其對(duì)砷的代謝.

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Effect of a symbiotic bacterium on the accumulation and transformation of arsenite by.

WANG Ya-ru1, PAN Xiao1, YU Qing-nan1, ZHANG Chun-hua2*, GE Ying1

(1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Marine Biology, College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2.Demonstration Laboratory of Elements and Life Science, Laboratory Centre of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)., 2019,39(10)：4303~4312

In order to investigate the effects of a symbiotic bacterium on arsenite (As(III)) accumulation and transformation of, one symbiotic bacterial strain was isolated from culture medium of. Antibiotics were added toto obtain the axenic microalga, and a series of As(III) treatments (0, 75, 150, 300, 750mg/L) were applied to the non-axenic and axenic. After 7 days, the absorption, adsorption and accumulation of As(III) bywere determined. The As speciation in the culture and algal cells were also analyzed and the rates of As(III) oxidation and removal bynon-axenic and axenicwere calculated. At the same time, the symbiotic bacterium was treated with different concentrations of As(III) for 7days, and with 300mg/L As(III) for different time. The oxidation and removal rates of As(III) in the bacterial culture medium were then calculated. Results show that the symbiotic bacterium was identified asWB-1.Compared with the axenic, the non-axenicgrew faster with higher tolerance to As(III). Moreover, in the presence of bacterium, As(III) accumulation byfrom the culture solution varied from 103.10 to 448.12mg/kg, the oxidation and removal rates of As(III) were 78.93%~96.88% and 18.92%~55.21%, respectively. These values were significantly higher than those of the axenic, which varied from 11.68 to 91.39mg/kg, 14.46%~26.39% and 12.82%~29.15%, respectively. The As(III) oxidation and removal rates in the non-axenicculture were also significantly higher than those in thecuture (4.51%~30.61% and 1.86%~16.19%, respectively). In addition, a small amounts of As(III) and methylated As were detected in the cells of non-axenic, while no methylated As was present in the axeniccells. Symbiotic bacteria promote the enrichment and transformation of As(III) by.

symbiotic bacteria；；arsenite；accumulation；speciation transformation

X171.5

A

1000-6923(2019)10-4303-10

王亞茹(1993-),女,山東德州人,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要研究方向?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境生態(tài)學(xué).

2019-03-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31770548,31400450);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科技平臺(tái)實(shí)驗(yàn)人才基金項(xiàng)目(SYSB201811)

* 責(zé)任作者, 高級(jí)實(shí)驗(yàn)師, chunhua@njau.edu.cn