實時熒光PCR檢測巴西孢子絲菌的實驗方法的建立

張明瑞 周盈 李福秋 姚春麗 楊鑫 龔杰 趙飛

(1.吉林大學第二醫(yī)院皮膚科，長春 130022；2.長春市中心醫(yī)院，長春 130051；3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是由孢子絲菌復合體(Sporothrixcomplex)感染皮膚、皮下組織、黏膜和局部淋巴系統(tǒng)所引起的慢性感染性疾病[1]。病程較長，皮損可固定于局部，或沿淋巴管走行，嚴重者可通過血行系統(tǒng)播散，引起內(nèi)臟器官的感染，也有報道稱吸入的孢子可直接引起肺部感染[2]。隨著分子檢測手段的不斷發(fā)展，通過對基因序列的種系研究表明，申克孢子絲菌是由多個親緣種構(gòu)成的復合體[3]，其中球形孢子絲菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子絲菌(Sporothrixschenckiisensustricto)、巴西孢子絲菌(Sporothrixbrasiliensis)以及盧里艾孢子絲菌(Sporothrixluriei) 是臨床感染中最常見的致病菌，其余孢子絲菌多為環(huán)境菌株，例如墨西哥孢子絲菌(Sporothrixmexicana)[4]。研究表明，不同種之間在致病力及藥物敏感性方面存在明顯差異[5-8]。因此，在孢子絲菌病的診斷及治療過程中，對病原菌鑒定到種是十分必要的。本研究擬建立一種快速、靈敏和特異的巴西孢子絲菌實時熒光PCR檢測方法，精準鑒定巴西孢子絲菌，為實驗室檢測、流行病學調(diào)查以及臨床快速診斷提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與DNA提取

實驗菌株：巴西孢子絲菌、球形孢子絲菌、申克孢子絲菌各1株，常見致病真菌其他種屬28株(見表1)。其中，申克孢子絲菌標準株CBS498.86T，巴西孢子絲菌標準株CBS 120339T，由中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所醫(yī)學真菌保藏中心惠贈，其余菌種來源于北京大學真菌和真菌病研究中心菌種保藏中心；3株表皮常見細菌的核酸，由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所診斷室惠贈。

上述所有菌種均經(jīng)過形態(tài)及分子鑒定至種水平。健康志愿者皮膚組織1份，BALB/c小鼠組織1份。上述菌種及組織標本使用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN 51306) 試劑盒按操作手冊提取核酸，提取的核酸-20℃冰箱保存。

1.2 主要試劑、儀器及實驗動物

2×Taqman PCR MasterMix (Solarbio)；Nuclease-free water (Promega)；Potato Dextrose Agar 培養(yǎng)基(BD 211550)；QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN 51306)。Real-time PCR儀C1000 Thermal Cycler (BIO RAD); Nanodrop2000C (Thermo)。BALB/c小鼠，雌性，6～10周齡，體重25～30 g。

表1 文中涉及的DNA及菌株列表

1.3 引物與探針

對NCBI數(shù)據(jù)庫中孢子絲菌所有種屬ITS基因序列進行比對，選取巴西孢子絲菌特異性序列，使用Primer Express Version軟件設計引物及TaqMan探針，并進行手動調(diào)整，熒光標記為Cy5，引物及探針序列見表2。引物及探針序列由上海生物工程股份有限公司合成。

表2 引物及探針序列

1.4 實時熒光PCR擴增條件優(yōu)化

體系退火溫度從55℃～62℃進行梯度優(yōu)化，確定擴增的最優(yōu)退火溫度。優(yōu)化檢測體系：2×Taqman PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物Sb-ITS-F(25 μmol/L) 0.2 μL，下游引物Sb-ITS-R(25 μmol/L) 0.2 μL，探針Sb-ITS-MGB-P(25 μmol/L) 0.1 μL，DNA模板 5.0 μL，Nuclease-free water 補至25.0 μL。體系使用BIO-RAD C1000 Thermal Cycler real-time PCR儀進行擴增。擴增條件：95℃預變性10 min，1個循環(huán)；95℃變性15s，58℃退火30s，45個循環(huán)。

1.5 實時熒光PCR體系特異性、靈敏度以及檢測限的測定

使用35種其他常見病原菌、人及小鼠基因組(見表1)進行體系特異度驗證。將巴西孢子絲菌標準株(CBS 120339T)核酸進行10倍濃度梯度稀釋(濃度從2ng/μL～0.2fg/μL，共計8個梯度濃度)，進行靈敏度及檢測下限的測定。

1.6 感染動物模型建立、組織培養(yǎng)及核酸提取

將巴西孢子絲菌標準株(CBS 120339T)轉(zhuǎn)種至PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，30℃，培養(yǎng)14 d。生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，收集菌液，無菌紗布過濾，除去菌絲及培養(yǎng)基成份，3500 r/min，離心收集孢子。棄上清，沉淀用少量無菌生理鹽水重懸，孢子懸液在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整菌液孢子濃度至107cells/mL。使用一次性無菌注射器吸取0.2 mL孢子懸液，腹腔注射感染BALB/c小鼠。感染14 d后脫頸處死，取臟器(腦、肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié))勻漿，取100 μL進行核酸提取及熒光PCR檢測，再取稀釋100倍后勻漿液100 μL接種在含有氯霉素的PDA培養(yǎng)基。

1.7 結(jié)果判讀

熒光PCR檢測每次須設立無模板對照(NTC)、陰性對照(NEG)和陽性對照(POS)，只有NTC(-)、NEG(-)、POS(+)，判定為有效擴增。檢測為有效擴增時，Ct值<40為陽性結(jié)果；Ct值>40為陰性結(jié)果。接種感染動物的6種組織勻漿的培養(yǎng)基置于30℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7 d后觀察，并設置陽性培養(yǎng)和空白對照。7 d后，有孢子絲菌菌落生長，為培養(yǎng)陽性結(jié)果；30 d后，仍無菌落生長則為培養(yǎng)陰性結(jié)果。

1.8 倫理聲明

本實驗中使用的人類基因組DNA及實驗動物均經(jīng)過吉林大學第二醫(yī)院倫理委員會批準(批號：2018-018)。實驗動物的使用符合實驗動物福利和倫理的要求，符合國家科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》等法規(guī)的規(guī)定。

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光PCR體系優(yōu)化

通過對NCBI數(shù)據(jù)庫孢子絲菌屬ITS序列對比，共設計出3套引物及探針組合。3套體系對于非孢子絲菌屬其他核酸均展示出良好特異性，但其中兩套體系對于申克孢子絲菌重復驗證時，有時會出現(xiàn)非特異性擴增。最終，1套不會引起屬內(nèi)的非特異性擴增的TaqMan MGB體系定為最終檢測體系(見表2)。在55～62℃范圍內(nèi)的退火溫度下，標準濃度核酸檢測Ct值相差0.64，經(jīng)重復試驗，選用Ct值最小的58℃作為最適退火溫度。

2.2 實時熒光PCR方法的特異性及檢測限的評價

本方法對33種常見病原菌、人類基因組以及小鼠基因組檢測結(jié)果均為陰性，特異性可達100%。 使用濃度從2 ng/mL～0.2 fg/mL的巴西孢子絲菌核酸擴增獲得標準曲線及對數(shù)曲線見圖1。按照優(yōu)化的反應體系和反應條件進行熒光PCR，每個濃度梯度做3個平行樣。結(jié)果顯示，本實驗中實時熒光PCR體系檢測限為100 fg。

2.3 感染動物模型組織培養(yǎng)及熒光PCR檢測結(jié)果

感染小鼠臟器勻漿培養(yǎng)，除腦組織外，培養(yǎng)結(jié)果全部陽性。對生長的真菌進行形態(tài)學及分子鑒定，均為巴西孢子絲菌，證明感染模型建立成功，并且孢子由腹腔播散，引起多臟器感染(見圖2)。6種組織勻漿核酸熒光PCR檢測結(jié)果，除腦組織陰性外，其余5種組織巴西孢子絲菌核酸檢測結(jié)果均為陽性，Ct值30.55～38.78(見圖3)。

3 討 論

巴西孢子絲菌是孢子絲菌復合體中重要的臨床致病菌，主要分布在巴西。其宿主除了人類之外，也可引起以貓等動物的感染。貓的口腔環(huán)境溫度為37.7～39.1℃，pH值為7.5～8.0，十分有利于巴西孢子絲菌酵母細胞生長繁殖。通過感染動物的抓咬，巴西孢子絲菌不僅能夠引起人類的感染，也可在動物之間傳播，成為其主要的傳播途徑[9]。作為重要的人畜共患病，由巴西孢子絲菌引起的孢子絲菌病，常具有較重的臨床表現(xiàn)，并且能夠引起內(nèi)臟及鄰近骨的感染，甚至侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致宿主死亡[10-12]。近些年，孢子絲菌病報道不斷增多，尤其是臨床表現(xiàn)嚴重的病例。在巴西，僅有記載的巴西孢子絲菌感染病例就超過4000例，并且由于孢子絲菌病不是必須上報的病種，其真實感染情況要遠高于記載數(shù)據(jù)[9]。

目前孢子絲菌診斷方法中，組織標本培養(yǎng)仍然是金標準[13]。但由于培養(yǎng)耗時較長，通常需要2～4周，不適用于臨床的快速診斷以及流行病學調(diào)查，因此基于核酸檢測的分子診斷逐漸成為研究熱點。目前應用于孢子絲菌檢測及鑒定的分子手段主要包括“生物條形碼”的擴增測序[3,14-18]、巢式PCR[19-20]、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP )[21]、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification, RCA)[22]以及特異性引物PCR[23]等。上述檢測方法中，除巢式PCR外，其余方法均能夠直接鑒定到孢子絲菌種水平。但是基于普通PCR的測序或者再酶切等方法，往往耗時較長，并且RFLP以及RCA只能用于純菌的檢測。2015年，由Rodrigues[23]建立的特異性引物PCR，依據(jù)不同孢子絲菌特定區(qū)域特異性PCR產(chǎn)物片段大小，可檢測并區(qū)分幾種常見的孢子絲菌。其對巴西孢子絲菌的檢測下限為100fg，并通過感染小鼠的內(nèi)臟組織模擬臨床標本，評估其檢測組織中的病原菌的能力，是目前報道的最靈敏和特異的孢子絲菌PCR檢測方法。熒光PCR技術(shù)憑借其靈敏度及特異性高，耗時短，重復性好、全封閉反應等重多優(yōu)勢，逐漸成為病原菌鑒定及診斷重要的工具，并且已經(jīng)廣泛且有效地運用在細菌(結(jié)核分枝桿菌)、病毒(HIV，HCV)以及一些真菌(曲霉)等病原微生物的診斷[24]。但是在孢子絲菌屬的檢測中應用較少。

圖1實時熒光PCR體系對巴西孢子絲菌標準濃度梯度核酸的擴增曲線(左)及模板濃度對數(shù)曲線(右)圖2巴西孢子絲菌感染小鼠內(nèi)臟組織培養(yǎng)結(jié)果(將內(nèi)臟組織勻漿稀釋100倍后，取100μL涂PDA平板，從左至右依次為腦、肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié))

Fig.1The amplification curves of the series gradient concentration templates (left) and standard curve of the real-time PCR assays(right).(1：10ng，2：1ng，3：100pg，4：10pg，5：1pg，6：100fg，7：10fg，8：1fg，9：NTC)Fig.2The culture results of tissues infected byS.brasiliensis.(left to right: brain, liver, lung, spleen, kidney and lymph nodes)

圖3實時熒光PCR檢測巴西孢子絲菌感染小鼠內(nèi)臟組織勻漿Ct值(Ct值從小到大以此為脾30.55，肝30.82，淋巴結(jié)34.04，腎34.46，肺38.78，腦組織為陰性結(jié)果)

Fig.3The Ct values of tissues infected byS.brasiliensisdetected by real-time PCR.(spleen 30.55, liver 30.82, lymph node 34.04, kidney 34.46, lung 38.78, brain tissue was negative.)

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通常包括ITS1、5.8S和ITS2，長度一般在500～750 bp。ITS區(qū)在進化過程中承受的自然選擇壓力比較小，能容忍更多的變異。其在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出廣泛的多態(tài)性，在親緣關(guān)系接近的物種中也能夠表現(xiàn)出差異，即具有種內(nèi)相對一致，種間差異明顯的特征。因而廣泛應用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。ITS序列具有高拷貝數(shù)的特點，在每個單倍染色體基因組中拷貝數(shù)超過200個，提高檢測的靈敏度。孢子絲菌屬中，巴西孢子絲菌的基因序列較保守，種間相似度很高，而申克孢子絲菌種內(nèi)序列具有很多差異位點[25]。這些差異片段，很容易導致屬內(nèi)的非特異性擴增，增加了特異性引物及探針的設計難度。同時，實時熒光PCR要求其目的片段長度為100～150 bp，在較短的基因片段上，既要設計出能夠擴增巴西孢子絲菌引物，同時也要設計出符合熒光PCR要求的探針，也是本研究的一個難點。通過軟件比對以及手動調(diào)整序列，我們共獲得3套候選的引物及探針組合。經(jīng)驗證后，得到1套含有TaqMan MGB探針的體系(見表2)，這套體系靈敏度及特異性良好，檢測下限為100 fg。雖然與特異性引物檢測方法的檢測下限相同，但是本研究方法無論從操作步驟、檢測時間、結(jié)果讀取以及污染風險方面，均具有明顯的優(yōu)勢。為進一步驗證本研究方法對組織中巴西孢子絲菌感染的檢測情況，實驗構(gòu)建了小鼠感染模型，并與組織培養(yǎng)進行對比。結(jié)果顯示，熒光PCR結(jié)果與金標準-培養(yǎng)方法對不同組織的檢測結(jié)果一致。目前國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)巴西孢子絲菌，因此本實驗方法只能通過標準株構(gòu)建，并通過感染動物模型進行驗證。缺乏臨床菌株的驗證，是本研究的不足之處。

綜上所述，本實驗成功建立巴西孢子絲菌的實時熒光檢測方法，并進行了感染動物模型驗證。該方法可以為流行病學研究及監(jiān)測，甚至臨床診斷提供技術(shù)支持。