3個(gè)耐鹽內(nèi)生菌對(duì)提高杜梨耐鹽能力的影響

談峰，王瑩，郭聰，李玉娟

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 如皋 226541)

改良鹽堿地的最佳技術(shù)方案是通過綠化降鹽，而篩選耐鹽堿樹木是首選。高耐鹽植物非常稀少，而可用種植于中高鹽含量土壤的樹種則更少，所以，通過一定的技術(shù)手段提高中低耐鹽樹木的耐鹽能力是一個(gè)好的思路。自然界中生物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性提高歷來有自身適應(yīng)性提高和外力干擾性提高2種。在植物對(duì)不良生存環(huán)境的適應(yīng)性提高中，依靠外力的作用提升是一種非常有效的技術(shù)手段，利用菌類與植物的共生關(guān)系提高植物在鹽堿條件下的生存能力也是一個(gè)研究方向。賀忠群等[1]對(duì)叢枝菌根真菌提高植物耐鹽性的機(jī)制進(jìn)行了研究，認(rèn)為菌根能促進(jìn)植物對(duì)關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素的吸收與利用，并減緩鹽離子對(duì)植物的毒害作用。自然界中能和植物形成共生關(guān)系的真菌不多，而形成共生且能促進(jìn)植物提高耐鹽能力的真菌就更少了，而在細(xì)菌中卻有不少耐鹽甚至嗜鹽的種類。丁新景等[2]研究認(rèn)為，阿氏芽孢桿菌等根際菌對(duì)雪蓮的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，尤其對(duì)根系生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯；井大煒等[3]的研究認(rèn)為，在一定條件下接種蠟樣芽孢桿菌能改善堿蓬根際土壤的微環(huán)境，在輕度鹽脅迫的條件下效果更好?？傮w而言，在利用天然微生物菌體改良植物耐鹽能力方面，所做的研究還不多。杜梨是優(yōu)秀的耐鹽堿樹種，但其不適合在含鹽量高于0.36%的中度鹽堿地種植。我們?cè)谘芯恐参锬望}性的過程中，提取某些高耐鹽植物的內(nèi)生耐鹽菌，放大培養(yǎng)后接種到無土基質(zhì)中，再進(jìn)行放大培養(yǎng)，用此培養(yǎng)基種植杜梨，觀察內(nèi)生耐鹽菌對(duì)杜梨耐鹽能力的影響。

1 材料與方法

1.1 耐鹽菌的獲取和培養(yǎng)

在江蘇如東海灘淺水處取鹽生植物大米草(SpartinaanglicaHubb.)等，在實(shí)驗(yàn)室分離植物內(nèi)生菌并提純。

分離培養(yǎng)基配方：黃豆50 g，瓊脂12 g。黃豆先制備豆?jié){，然后用含鹽量10%的海水兌至1 L，加入瓊脂，溶解，滅菌后冷卻備用。

擴(kuò)大培養(yǎng)基配方：牛肉浸膏20 g，精解蛋白胨15 g，馬鈴薯200 g，瓊脂13 g，加含鹽10%的海水至1 L，滅菌，冷卻，接種。

液體菌種配方：牛肉浸膏20 g，精解蛋白胨15 g，馬鈴薯2 500 g，黃豆粉15 g，加含鹽10%的海水至1 L。按常規(guī)液體菌種培養(yǎng)方式進(jìn)行。

1.2 無土基質(zhì)的配制

按體積比將木腐菌糠30%、秸稈20%、雙孢蘑菇菌糠50%均勻混合。所有菌糠料和秸稈料均腐熟發(fā)酵。按體積比20∶1混入耐鹽菌液體菌種，水分調(diào)節(jié)使用含鹽15%的海水，堆積培養(yǎng)10 d，備用。

1.3 杜梨種植

以28 cm×17 cm花盆為容器移栽杜梨，根部分帶少量心土和洗凈2種處理。每樣本50株，地徑1 cm，定高50 cm，全去葉，以含鹽4%的海水噴霧基質(zhì)表面保持基質(zhì)濕潤(rùn)。記錄植株發(fā)芽與情況。生長(zhǎng)穩(wěn)定后，取樣測(cè)量根系萌發(fā)數(shù)量與生長(zhǎng)長(zhǎng)度，以根系萌發(fā)并健康生長(zhǎng)為指標(biāo)來確定杜梨成活。

1.4 菌株侵入檢測(cè)

取新生根分離，檢查是否有菌株進(jìn)入植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽菌菌株

從鹽生植物大米草等體內(nèi)分離獲得了3個(gè)耐鹽的菌株，命名為BR1、BR2、BR3。經(jīng)鏡檢，這3個(gè)菌株均屬于細(xì)菌類。3個(gè)菌的菌株單體球形，被毛，菌落念珠狀，光滑。BR3菌株單菌鏡檢形態(tài)見圖1。3個(gè)菌株的皿培形態(tài)見圖2，BR1蛋黃色，BR2有油性，BR3乳白色。皿培培養(yǎng)接種20 h菌株開始萌動(dòng)，48 h菌落成型；液體培養(yǎng)5 d菌液成熟，菌液有臭雞蛋味，液體表面有沬，中間可見混濁懸浮體。

圖1 BR3單菌的鏡檢

圖2 3個(gè)菌株的培養(yǎng)結(jié)果

2.2 基質(zhì)

培養(yǎng)成熟的基質(zhì)手握有黏稠感，稍有彈性，輕微腐臭味，這是耐鹽菌在基質(zhì)中得到進(jìn)一步生長(zhǎng)并成熟的標(biāo)志。耐鹽菌能在基質(zhì)中存活并先行利用基質(zhì)的材料是確保兩者能完美融合的基礎(chǔ)，適當(dāng)?shù)木w數(shù)量是保證耐鹽菌優(yōu)勢(shì)菌群的重要基礎(chǔ)，只有具備了適當(dāng)?shù)哪望}菌群數(shù)量的基質(zhì)，才有可能保證在植株栽植后，能夠得到有效的侵入與融合。

2.3 杜梨生長(zhǎng)情況

杜梨在經(jīng)過20 d的培養(yǎng)以后，對(duì)鹽堿的適應(yīng)性開始出現(xiàn)差異，標(biāo)志是新生葉的萎蔫和隨后的植株死亡。植物根系是維系植物生長(zhǎng)的根本，葉片通過光合作用制造植物繼續(xù)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)，保證植物生長(zhǎng)持續(xù)。葉片死亡即代表植物失去了獲得新生力量的能力。

在植株栽入盆缽后8～10 d，所有植株均開始萌發(fā)新芽，并陸續(xù)發(fā)生新葉。但自21 d開始，陸續(xù)有植株的葉片開始萎蔫，最先發(fā)生萎蔫的是經(jīng)BR1菌處理的，至36 d，杜梨所有葉片全枯死；BR2處理中的杜梨洗根苗全部萎蔫，帶心土杜梨苗葉片沒有萎蔫，但也沒有繼續(xù)生長(zhǎng)；BR3處理的洗根和帶心土的杜梨苗葉片有生長(zhǎng)的現(xiàn)象，標(biāo)志為新芽頂部開始拉長(zhǎng)。

杜梨植入盆體60 d，所有萎蔫植株沒有新葉發(fā)生，存活新葉的植株新枝明顯生長(zhǎng)。BR2心土處理、BR3洗根與心土處理杜梨均有新根生長(zhǎng)，所有己萎蔫的植株均無新根發(fā)生的痕跡。

3個(gè)菌株處理基質(zhì)中BR2、BR3新根生長(zhǎng)見圖3，表明不是所有的植物耐鹽內(nèi)生菌都對(duì)其他植物有效，菌株的適應(yīng)性篩選很重要。是否正常發(fā)生出新生根，是判斷植物移栽是否真正成活的主要指標(biāo)。杜梨在含3個(gè)菌株的基質(zhì)上生根表現(xiàn)差異較大：BR1沒有效果，BR2在移栽植株保留有原生土的情況下是能夠成活的，但沒有原生土則不能成活；而BR3無論是帶心土移栽，還是不帶心土移栽，均能很好地生根，帶心土的生根更好，根系也更發(fā)達(dá)。

圖3 BR2、BR3成活處理的杜梨根系生長(zhǎng)

培養(yǎng)90 d，測(cè)量杜梨中新生根條數(shù)、根長(zhǎng)，結(jié)果顯示，在正常生長(zhǎng)新根的處理中，不同菌株對(duì)杜梨在高鹽基質(zhì)中的生根數(shù)量、生根速度、新生根生長(zhǎng)速度影響差異較大(表1)。在高鹽條件下，添加了BR3菌株的基質(zhì)中盆栽杜梨生長(zhǎng)較好，在以4%含鹽量的海水作為噴灌用水的條件下仍然能夠生長(zhǎng)，添加BR2菌株的基質(zhì)上杜梨能夠成活，添加BR1菌株的基質(zhì)上杜梨無法存活。曾廣萍等[4]研究表明，AM真菌可以提高植物的耐鹽性。BR2、BR3均分離自非杜梨淺海水植物，含有該菌的基質(zhì)可以促進(jìn)杜梨在高鹽度環(huán)境存活并獲得生長(zhǎng)。

表1 3個(gè)菌株的生根結(jié)果

2.4 新生根菌株分離

對(duì)杜梨新生根組織進(jìn)行分離培養(yǎng)，在含BR2和BR3菌株的基質(zhì)上長(zhǎng)出的新生根中分離出了耐鹽細(xì)菌，經(jīng)拮抗對(duì)比試驗(yàn)確認(rèn)為接入基質(zhì)的同種菌，說明，此菌是通過基質(zhì)進(jìn)入杜梨組織，杜梨借由此菌之力，在高鹽基質(zhì)中萌發(fā)新根，從而確保成活。

BR2、BR3均可從培養(yǎng)的杜梨植株新生根中分離到，結(jié)合杜梨在高鹽基質(zhì)中的存活與生長(zhǎng)情況，可以確定這2個(gè)菌株與杜梨形成了共生關(guān)系，從而為杜梨在高鹽基質(zhì)中的生存提供了環(huán)境保證，張靜等[5]研究認(rèn)為，硫氧化細(xì)菌可改良鹽堿土中的堿性，通過改善植物生長(zhǎng)的pH環(huán)境來影響植物生長(zhǎng)的條件。杜梨的耐鹽極限是0.30%，至0.36%則全死亡[6]。本研究證明，在添加了BR2、BR3的基質(zhì)中移栽的杜梨，可以在鹽濃度4.00%的基質(zhì)中存活并生長(zhǎng)，管理過程以4.00%的海水作為生產(chǎn)管理用水不影響杜梨的生長(zhǎng)。

3 小結(jié)

植物內(nèi)生菌是指存活于健康植物組織內(nèi)部，又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群，這可能是由于內(nèi)生細(xì)菌生活在植物組織內(nèi)部，與宿主植物形成了緊密的共生關(guān)系，引發(fā)的多種效應(yīng)的綜合結(jié)果。本研究中2個(gè)菌株的效果良好，這是否與基質(zhì)本身的高營(yíng)養(yǎng)有關(guān)？而鹽堿實(shí)地的土壤營(yíng)養(yǎng)含量很低，BR2、BR3菌株在實(shí)地移栽中的效果是否與盆栽一樣？一定范圍內(nèi)添加這種基質(zhì)是否能解決植物在鹽堿地中的移栽成活難題？還有待于進(jìn)一步的研究。