鼠抗人CD28單克隆抗體的制備及體外生物學(xué)活性的初步研究①

沈立軍 孔 永 顏天銘 王玉玉 王 婧 邱玉華

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系，蘇州215123)

T細(xì)胞表達(dá)的CD28是迄今公認(rèn)的經(jīng)典共刺激信號(hào)B7/CD28通路的重要組成分子[1,2]，在T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答中,CD28分子作為受體與APC表達(dá)的天然配體B7-1、B7-2相互作用后,介導(dǎo)T細(xì)胞活化所需的協(xié)同刺激信號(hào)。該信號(hào)能增加IL-2分泌促進(jìn)活化、存活以及延緩T細(xì)胞失能[3,4]。對(duì)該信號(hào)進(jìn)行靶向調(diào)控，可促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤的排斥和腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究利用本室構(gòu)建保存的鼠抗人CD28單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，制備CD28單抗，采用Protein A免疫親和層析法獲得純化抗體，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行分子和細(xì)胞水平的研究，分析其與重組及天然CD28的結(jié)合活性，結(jié)合動(dòng)力學(xué)特性，以及對(duì)T細(xì)胞增殖的影響，以評(píng)價(jià)該抗體的體外生物學(xué)活性，并為后續(xù)體內(nèi)研究提供研究材料和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑、儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone；ProteinA親和層析柱購(gòu)自Merck；人CD28-小鼠IgG2a-Fc、人CD28-His購(gòu)自ACROBiosystems；Zeba Spin Desalting Columns(7K MWCO)、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin、SA-HRP、小鼠抗人CD3激發(fā)抗體購(gòu)自Thermo；TMB顯色液購(gòu)自KPM；PE標(biāo)記的小鼠抗Biotin抗體購(gòu)自Biolegend；Histopaque-1077淋巴細(xì)胞分離液、降植烷(Pristane)購(gòu)自Sigma-Aldrich；CellTiter-Glo Lumine-scent Cell Viability Assay購(gòu)自Promega。Biacore(T200)、蛋白純化儀(AKTA explover 100)、Series S Sensor Chip CM5購(gòu)自GE公司；尼龍毛柱購(gòu)自Polysciences；高效液相色譜儀購(gòu)自Waters；流式細(xì)胞儀(FACSAriaⅢ)購(gòu)自BD；酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices。

1.1.2細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 能穩(wěn)定分泌鼠抗人CD28單抗的雜交瘤細(xì)胞株6E8由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；Jurkat購(gòu)自ATCC，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系本課題組保存并常規(guī)傳代培養(yǎng)；3～5周齡健康雌性裸鼠(BALB/c-nu)購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)動(dòng)物管理中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2方法

1.2.1雜交瘤細(xì)胞6E8的復(fù)蘇和抗體的制備與純化 取保存的雜交瘤細(xì)胞6E8，進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)和擴(kuò)增。收集生長(zhǎng)旺盛的雜交瘤細(xì)胞注入已經(jīng)過(guò)Pristane致敏的裸鼠腹腔中，1×107個(gè)/只，輕輕按摩裸鼠腹部，使雜交瘤細(xì)胞充分分散在裸鼠腹腔，7～10 d后當(dāng)腹部隆起時(shí)，抽取腹水。經(jīng)3 000 r/min，離心10 min，收取上清。將上清以PBS稀釋1倍約35 ml后采用Protein A親和免疫層析法對(duì)抗體進(jìn)行純化，0.25 ml/min上樣，經(jīng)柱平衡和洗脫共收集洗脫液約10 ml。洗脫液調(diào)整pH值至7.1，并經(jīng)0.22 μmol/L 過(guò)濾除菌后，測(cè)定OD280 nm進(jìn)行濃度定量后分裝并于-80℃保存。

1.2.2分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC)分析純度、降解和聚體 流動(dòng)相為0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.2)；流速0.5 ml/min；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，上樣量30 μg。用Waters高效液相分析儀系統(tǒng)工作站對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法計(jì)算出其純度及降解、聚體比例。

1.2.3ELISA檢測(cè)抗體與重組人CD28的結(jié)合活性 采用EZ-Link?Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑按照操作說(shuō)明對(duì)小鼠抗人CD28單克隆抗體進(jìn)行Biotin偶聯(lián)標(biāo)記。將人CD28-小鼠IgG2a-Fc 1 μg/ml，50 μl/孔包被酶標(biāo)板2～8℃過(guò)夜后，棄去包被液，洗板，0.5%BSA-PBS封閉2 h，洗板后加入100 μg/ml起始1∶5 梯度稀釋的Biotin標(biāo)記CD28抗體50 μl/孔，置室溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢洗板，加入50 μl/孔 200 ng/ml SA-HRP置室溫反應(yīng)1 h，洗板后加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，讀取OD450 nm值，并采用Softmax軟件進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，計(jì)算EC50值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)抗體與Jurkat細(xì)胞膜表達(dá)的天然人CD28結(jié)合活性 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)旺盛的Jurkat細(xì)胞，以PBS離心洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min，5 min。用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)后分于流式分析管中，1×106個(gè)/管，離心去除上清后分別加入100 μl/管梯度稀釋(62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0 μg/ml)的CD28 抗體，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。4℃條件下孵育30 min，用PBS洗2遍，再加入PE標(biāo)記的小鼠抗Biotin抗體0.5 μg/管，100 μl/管，4℃避光條件下孵育30 min。再次洗滌后，用500 μl/管PBS重懸細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)FlowJo軟件進(jìn)行分析，采集不同劑量抗體組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度并采用Softmax軟件進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，計(jì)算EC50值。

1.2.5表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測(cè)抗體與人CD28結(jié)合動(dòng)力學(xué)特性 將人CD28-His稀釋至1 μg/ml，流穿偶聯(lián)抗His抗體的Series S Sensor Chip CM5芯片，捕獲時(shí)間為45 s，流速為10 μl/min。將CD28 抗體進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋?zhuān)灿?jì)10個(gè)濃度，即濃度為：1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、0 nmol/L，將稀釋完成的樣品從低濃度到高濃度依次流穿芯片進(jìn)行結(jié)合、解離，結(jié)合時(shí)間為60 s，解離時(shí)間為600 s，流速 30 μl/min，檢測(cè)結(jié)束后選擇Kinetics選項(xiàng)中1∶1 Binding模式進(jìn)行曲線擬合，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，確定其動(dòng)力學(xué)常數(shù)。

1.2.6CD28抗體對(duì)外周血T細(xì)胞增殖的影響 設(shè)置以下實(shí)驗(yàn)組：①用羊抗鼠IgG(20 μg/ml)包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,200 μl/孔,4℃搖動(dòng)過(guò)夜,棄上清,用PBS洗3遍,加入 100 μl/孔激發(fā)型CD28單抗6E8(濃度為5 μg/ml)；②用激發(fā)型CD28單抗6E8包被；③將L929-B7-1細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素處理后(每1×107細(xì)胞,離心棄上清,加入1 mg/ml時(shí)絲裂霉素溶液 50 μl,置于37℃、 45 min,洗滌3次),加入96孔培養(yǎng)板,5×104個(gè)/孔。 然后各實(shí)驗(yàn)組分別加入經(jīng)E-花結(jié)實(shí)驗(yàn)獲取的PBTC(CD3+T>95%),1×105個(gè)/孔,并調(diào)整體積至200 μl/孔。 設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組。各實(shí)驗(yàn)組均為多個(gè)復(fù)孔。部分孔2～3 d換液(原條件培養(yǎng)液),維持培養(yǎng)2周,逐日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞總數(shù)并繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1CD28抗體的制備、純化及純度分析 采用小鼠腹水誘生法制備單克隆抗體，10只裸鼠均形成腹水，收集的腹水產(chǎn)量平均為2.1 ml/只。經(jīng)Protein A免疫親和層析法對(duì)抗體進(jìn)行純化，共收集抗體洗脫液9.5 ml，經(jīng)OD280 nm測(cè)定進(jìn)行定量，為2.4 mg/ml，經(jīng)計(jì)算腹水中抗體蛋白的得率為1.1 mg/ml。純化后的抗體進(jìn)行分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC)檢測(cè)，結(jié)果表明其純度為95.1%、降解和聚體比例分別為0.4%、4.5%。見(jiàn)圖1。

2.2CD28抗體結(jié)合重組及Jurkat膜表達(dá)的天然人CD28活性分析 經(jīng)ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明CD28抗體能夠識(shí)別結(jié)合重組人CD28抗原(圖2)，其EC50值為19.8 μg/ml，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(圖3、4)也顯示該抗體能夠識(shí)別Jurkat細(xì)胞表達(dá)的天然人CD28分子，其EC50值為15.2 μg/ml，說(shuō)明本抗體具有較好的抗原結(jié)合活性。

圖1 分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC)分析CD28抗體純度Fig.1 Purity of CD28 mAb was detected by SEC-HPLC

圖2 ELISA檢測(cè)CD28抗體與重組人CD28的結(jié)合活性Fig.2 ELISA of binding activity of CD28 mAb to human recombinant antigen of CD28

圖3 FCM檢測(cè)CD28抗體與Jurkat細(xì)胞表面CD28的結(jié)合(陽(yáng)性率)Fig.3 FCM of binding activity of CD28 mAb to membrane CD28 of Jurkat(positive rate)

圖4 FCM檢測(cè)CD28抗體與Jurkat細(xì)胞表面CD28的結(jié)合(平均熒光強(qiáng)度)Fig.4 FCM of binding activity of CD28 mAb to membr-ane CD28 of Jurkat(average fluorescent intensity)

圖5 表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測(cè)抗體與人CD28結(jié)合動(dòng)力學(xué)特性Fig.5 Kinetic assay on CD28 mAb to human CD28 antigen by SPR

圖6 6E8激發(fā)的PBTC的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of PBTC stimulated by 6E8Note: *.P<0.05 vs L929-B7-1.

2.3CD28抗體結(jié)合人CD28動(dòng)力學(xué)特性 抗原結(jié)合親和力檢測(cè)是評(píng)價(jià)抗體結(jié)合能力的重要指標(biāo)，采用SPR技術(shù)分析了CD28與抗原的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示本抗體結(jié)合CD28的親和力為2.13×10-9M，結(jié)合常數(shù)為1.55×1051/Ms，解離常數(shù)為3.30×10-41/s，顯示本抗體具有較好的親和力(圖5)。

2.4CD28抗體對(duì)外周血T細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示(圖6)，直接包被或經(jīng)羊抗鼠IgG先行包被后再加入游離6E8均能引發(fā)T細(xì)胞的活化與增殖。細(xì)胞活化的起始時(shí)間、 最大增殖強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間均較L929-B7-1刺激者強(qiáng)而持久(P<0.05)。

3 討論

抗細(xì)胞膜型分子的單抗，根據(jù)其與相應(yīng)抗原分子結(jié)合后產(chǎn)生的效應(yīng)不同可分為三種類(lèi)型：與抗原分子結(jié)合后能增強(qiáng)或阻斷該分子介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，分別稱(chēng)為激發(fā)型或阻斷型，抗原抗體交聯(lián)后對(duì)抗原分子功能無(wú)影響者稱(chēng)為無(wú)功能型抗體。本研究在成功構(gòu)建了穩(wěn)定分泌激發(fā)性單抗CD28的雜交瘤細(xì)胞株6E8的基礎(chǔ)上[5]，運(yùn)用SEC-HPLC及FCM對(duì)抗體的純度及結(jié)合功能進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)小鼠腹水誘生法制備單抗，采用免疫親和層析進(jìn)行純化，獲取抗人CD28單抗的純化品。為研究該抗體的生物學(xué)特性，我們選取多種不同來(lái)源的CD28抗原與之結(jié)合，分析了抗人CD28對(duì)相應(yīng)抗原分子的識(shí)別能力及介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。

雜質(zhì)控制是單抗藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性中保障藥物安全性的重要指標(biāo)，在滿(mǎn)足如宿主DNA、宿主細(xì)胞蛋白、proteinA殘留等單抗藥物常見(jiàn)的工藝殘留雜質(zhì)符合安全標(biāo)準(zhǔn)和微生物安全的前提下，還需要控制與蛋白本身相關(guān)的雜質(zhì)[6,7]。我們首先采用SEC-HPLC分析了CD28單抗的純度。結(jié)果表明其純度為95.1%、降解和聚體比例分別0.4%、4.5%，預(yù)示較低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)而將CD28抗體與人CD28-小鼠IgG2a-Fc及Jurkat膜表達(dá)的天然人CD28結(jié)合，其EC50值分別為19.8 μg/ml及15.2 μg/ml，說(shuō)明本抗體能夠識(shí)別、結(jié)合重組和天然表達(dá)的CD28，顯示出良好的結(jié)合活性。

Biacore是基于 SPR 并用于實(shí)時(shí)觀察生物分子相互作用的技術(shù)，其可得到很多傳統(tǒng)技術(shù)難以提供的生物分子相互作用信息。目前，Biacore 技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、新藥開(kāi)發(fā)、遺傳學(xué)分析及食品檢測(cè)等領(lǐng)域已顯示出廣闊的應(yīng)用前景[8]。本實(shí)驗(yàn)使用Biacore(T200) 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了抗體與抗原的結(jié)合和解離的過(guò)程，測(cè)得CD28抗體6E8的親和力為2.13×10-9M，結(jié)合常數(shù)為1.55×1051/Ms，解離常數(shù)為3.30×10-41/s，顯示本抗體具有較好的親和力。

機(jī)體在腫瘤狀態(tài)下，腫瘤特異性T細(xì)胞處于免疫耐受狀態(tài)，CD28激發(fā)型單抗在體內(nèi)外均可有效逆轉(zhuǎn) T 細(xì)胞的耐受，再次激發(fā)其抗腫瘤效應(yīng)[9,10]。本試驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上，又以羊抗鼠IgG預(yù)包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后加入CD28單抗6E8，或者直接CD28單抗6E8預(yù)包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，均可引發(fā)T細(xì)胞的活化與增殖效應(yīng)。提示CD28單抗6E8為激發(fā)型單抗，其與T細(xì)胞CD28分子識(shí)別結(jié)合后，產(chǎn)生類(lèi)似于天然配基B7分子的作用，刺激T細(xì)胞活化、增殖以及分化，從而介導(dǎo)免疫效應(yīng)。

靶向CD28的單抗藥物在開(kāi)發(fā)和研究過(guò)程中亦有新的挑戰(zhàn)出現(xiàn)，TeGenero公司開(kāi)發(fā)的治療白血病的CD28激發(fā)單抗TGN1412在藥物Ⅰ期臨床試驗(yàn)中部分受試者出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，這提示靶向抗體藥物亦存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，也為我們開(kāi)發(fā)創(chuàng)新性單抗藥物提出了新的要求[11]。