西達(dá)本胺對腎癌786-O細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲的影響及其機(jī)制①

顏國華 高 鵬 王世廣 王麗君

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，新鄭451100)

腎癌是來源于腎小管上皮細(xì)胞的腺癌，其中70%以上為腎透明細(xì)胞癌[1]。全世界每年新增腎癌患者約40.3萬例，每年死于腎癌者達(dá)17.5萬例[2]。由于腎癌缺乏可靠的診斷標(biāo)志物和早期臨床癥狀，約30%的患者在確診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，這部分患者的中位生存期僅為1年[3]。腎癌對放化療不敏感，手術(shù)切除仍然是腎癌治療的主要手段，但術(shù)后存在較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[4]。近年來，針對腎癌的分子靶向治療取得了快速發(fā)展。索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和阿昔替尼等腎癌靶向藥物已應(yīng)用于臨床，然而臨床治療效果并不理想[5]。因此，研發(fā)新的靶向藥物仍然是目前腎癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。西達(dá)苯胺(Chidamide，CDM)是我國自主研發(fā)的首個(gè)選擇性組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor，HDACi)，通過表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和抗原特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷作用等方面發(fā)揮抗腫瘤作用[6-9]。但目前關(guān)于CDM對腎癌細(xì)胞的抑制作用在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究以人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞和人正常腎小管上皮HKC細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，旨在探究CDM對786-O細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲的影響及其機(jī)制。本研究將為腎癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞和人腎小管上皮HKC細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；CDM(批號420001-201201，100 mg/支，純度≥99.5%)購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司；DMSO、PI、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室購自美國Corning公司；Edu-555細(xì)胞增殖檢測試劑盒、結(jié)晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Cyclin依賴激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP2)、MMP9、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 786-O細(xì)胞和HKC細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%時(shí)，用0.25 %的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

1.2.2藥物配置 將CDM溶于二甲基亞砜(Dime-thyl sulfoxide，DMSO)配制成100 mmol/L的儲備液，分裝后于-20℃保存；使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，其中DMSO終濃度為0.05%；對照組使用含0.05% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期786-O細(xì)胞和HKC細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)的數(shù)量接種于96孔板；培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)孔分別加入100 μl含不同濃度CDM(0.5、1、2、5、10、20 μmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔和對照孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度A值；計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零組A值)/(對照組A值-調(diào)零組A值)×100%；使用SPSS16.0軟件的Probit回歸模型計(jì)算CDM對786-O細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4EdU摻入法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期786-O細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)的數(shù)量接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后去上清，加入不同劑量CDM (0、5、10 μmol/L)處理48 h；加入1 ml用細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶500 稀釋的EdU溶液，37℃孵育2 h；PBS洗滌2次，加入1 ml固定液，室溫固定15 min；PBS洗滌2次，加入1 ml通透液，室溫孵育15 min；PBS洗滌2次，加入0.5 ml Click反應(yīng)液，室溫避光孵育 30 min；PBS洗滌2次，使用流式細(xì)胞儀檢測EdU陽性細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞處理同1.2.4，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次；加入1 ml 70%冰乙醇于4℃固定24 h；PBS洗滌2次，加入碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色液，4℃避光染色30 min；使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理同1.2.4，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次；重懸細(xì)胞于400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液中，加入5 μl AnnexinV-FITC，4℃避光孵育15 min；加入10 μl PI染色液，4℃避光孵育15 min；使用流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 將Matrigel基質(zhì)膠與RPMI1640培養(yǎng)基按1∶6 稀釋，取50 μl均勻鋪到Transwell小室的底部，然后將Transwell小室放入24孔板中，于37℃孵育過夜使其成凝膠狀；向小室下方的24孔板中加入600 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，向小室內(nèi)加入經(jīng)不同劑量CDM(0、0.5、1 μmol/L)處理48 h后的786-O細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量為4 000個(gè)/孔)，37℃孵育12 h；取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)的Matrigel基質(zhì)膠和細(xì)胞，PBS洗滌2次，甲醛固定30 min；PBS洗滌2次，結(jié)晶紫染色20 min；PBS 洗滌2次，顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞，隨機(jī)挑選5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)；計(jì)算侵襲率，侵襲率(%)=(實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8Western blot法檢測蛋白水平 收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照，使用Image J1.45s軟件進(jìn)行灰度分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度比作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1CDM對細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，與對照組相比，不同劑量CDM(0.5、1、2、5、10、20 μmol/L)處理48 h后，786-O細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)，且隨著CDM劑量的增加呈下降趨勢，IC50為11.83 μmol/L；而HKC細(xì)胞活力在20 μmol/L濃度作用下才明顯降低(P<0.05)。這表明CDM對人正常腎小管上皮HKC細(xì)胞的毒性作用較小，但對人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性作用，并呈劑量依賴性。

2.2CDM對786-O細(xì)胞增殖的影響 如圖2所示，與對照組相比，5 μmol/L和10 μmol/L CDM組細(xì)胞的EdU陽性率顯著降低(P<0.05)；同時(shí)，10 μmol/L CDM組細(xì)胞的EdU陽性率顯著高于5 μmol/L CDM組(P<0.05)。這表明CDM可劑量依賴性地抑制786-O細(xì)胞增殖。

2.3CDM對786-O細(xì)胞周期的影響 如圖3所示，與對照組相比，5 μmol/L和10 μmol/L CDM組G2/M期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，G0/G1期和S期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)；與5 μmol/L CDM組相比，10 μmol/L CDM組G2/M期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，G0/G1期和S期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)。這表明CDM可誘導(dǎo)786-O細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，且呈劑量依賴性。

圖1 786-O和HKC細(xì)胞活力的變化Fig.1 Changes of cell viability in 786-O and HKC cellsNote: *.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 2 μmol/L CDM group；△.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group；▲.P<0.05 versus 10 μmol/L CDM group.

2.4CDM對786-O細(xì)胞凋亡的影響 如圖4所示，與對照組相比，5 μmol/L和10 μmol/L CDM組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；10 μmol/L CDM組細(xì)胞凋亡率顯著高于5 μmol/L CDM組(P<0.05)。這表明CDM可劑量依賴性地誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡。

2.5CDM對Cyclin B1、CDK1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響 如圖5所示，與對照組相比， 5 μmol/L和10 μmol/L CDM組細(xì)胞中Cyclin B1、CDK1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；且5 μmol/L和10 μmol/L CDM組間Cyclin B1、CDK1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 CDM抑制786-O細(xì)胞增殖Fig.2 CDM inhibits proliferation of 786-O cellsNote: A.EdU assay；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

圖3 CDM阻滯786-O細(xì)胞于G2/M期Fig.3 CDM arrests cell cycle of 786-O cells at G2/M phaseNote: A.Cell cycle analysis；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；**.P<0.01 versus control group;#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

圖4 CDM誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡Fig.4 CDM induces apoptosis of 786-O cellsNote: A.Apoptosis detection；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

圖5 CDM對786-O細(xì)胞Cyclin B1、CDK1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of CDM on protein expression of Cyclin B1,CDK1,Bcl-2 and Bax in 786-O cellsNote: A.Western blot assay；B.Statistical analys.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

2.6CDM對786-O細(xì)胞侵襲的影響 在采用Transwell法檢測細(xì)胞侵襲時(shí)，為避免因藥物劑量過大對細(xì)胞活力產(chǎn)生的抑制作用，本研究選擇對細(xì)胞活力未產(chǎn)生明顯抑制作用的0.5和1 μmol/L兩個(gè)濃度。如圖6所示，與對照組相比，0.5 μmol/L和1 μmol/L CDM組細(xì)胞侵襲率顯著降低(P<0.05)；同時(shí)，1 μmol/L CDM組細(xì)胞侵襲率顯著高于0.5 μmol/L CDM組(P<0.05)。這表明CDM可劑量依賴性地抑制786-O細(xì)胞侵襲。

2.7CDM對MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平的影響 如圖7所示，與對照組相比，0.5 μmol/L和1 μmol/L CDM組細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；同時(shí)，1 μmol/L CDM組細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著低于0.5 μmol/L CDM組(P<0.05)。

圖6 CDM抑制786-O細(xì)胞侵襲Fig.6 CDM inhibits invasion of 786-O cellsNote: A.Transwell assay；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 0.5 μmol/L CDM group.

圖7 CDM對786-O細(xì)胞MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平的影響Fig.7 Effect of CDM on protein expression of MMP2 and MMP9 in 786-O cellsNote: A.Western blot assay；B.Statistical analys.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 0.5 μmol/L CDM group.

3 討論

目前，在中國臨床上已經(jīng)普及應(yīng)用的腎癌靶向治療藥物有索拉非尼、舒尼替尼、阿昔替尼和培唑帕尼。這4種藥物均以血管內(nèi)皮生長因子受體為靶點(diǎn)，通過抗腫瘤血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管腎癌靶向治療藥物有效提高了晚期腎癌患者的客觀緩解率及無進(jìn)展生存期，但仍具有一定毒副作用，并且患者最終幾乎都會出現(xiàn)耐藥[10]。HDACi可通過特異性調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化水平以逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生與進(jìn)展過程中的表觀遺傳學(xué)改變，憑借其顯著的治療效果和較小的毒副作用，成為目前受國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注的、最有前景的一類抗腫瘤藥物[11]。

由我國自主研發(fā)的CDM是全球首個(gè)獲準(zhǔn)上市的亞型選擇性HDACi，目前已批準(zhǔn)用于治療外周T細(xì)胞淋巴瘤。最近的研究表明，CDM對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，如多發(fā)性骨髓瘤、白血病、腺樣囊性癌、肺癌和胰腺癌等，因而成為有潛力的抗腫瘤藥物[12-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，CDM對人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞具有顯著的毒性作用，IC50為11.83 μmol/L，并呈劑量依賴性地抑制786-O細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。

腫瘤細(xì)胞以有絲分裂的方式進(jìn)行增殖，從一次有絲分裂完成到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程稱為細(xì)胞周期，分為G0/G1期、S期和G2/M期。每個(gè)時(shí)期具有各自特征性的Cyclin，而Cyclin可激活特定的CDK，磷酸化相應(yīng)的底物，使細(xì)胞周期順序推進(jìn)[17]。在G2期，Cyclin B1與CDK1形成的復(fù)合物稱為成熟促進(jìn)因子(Maturation promoting factor，MPF)，它可以使細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期[18]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，CDM可阻滯多種腫瘤細(xì)胞于G2/M期，如白血病、腺樣囊性癌、肺癌和胰腺癌[13-16]。本研究證實(shí)，高劑量CDM誘導(dǎo)786-O細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，這可能與其劑量依賴地下調(diào)Cyclin B1和CDK1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

Bcl-2蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[19，20]。Bcl-2蛋白家族以功能可以分為兩大類：一類是抗凋亡蛋白，主要有Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl和骨髓細(xì)胞白血病因子1等；另一類是促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bad、Bak和Bid等。Bax可通過插入線粒體外膜并聚合成孔道，或與線粒體外膜的電壓依賴性離子通道結(jié)合致使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開放，觸發(fā)線粒體外膜透化，使線粒體膜間腔中的多種促凋亡蛋白釋放至胞漿，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。定位在線粒體外膜上的Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量CDM可劑量依賴性地誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡，這可能與其下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)以及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜是限制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要屏障，但腫瘤細(xì)胞可通過分泌多種MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜從而侵入周邊組織，并穿入血管和淋巴管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。MMPs屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，其中MMP2和MMP9主要降解Ⅳ型膠原蛋白，而Ⅳ型膠原蛋白正是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分。Sitaram等[22]研究證實(shí)，MMP抑制劑TAPI-2可阻斷轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)的腎癌786-O細(xì)胞和A498細(xì)胞侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，低毒劑量CDM可抑制786-O細(xì)胞侵襲，這可能與其劑量依賴性地下調(diào)MMP2和MMP9蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，CDM可在體外劑量依賴性抑制人腎癌786-O細(xì)胞增殖和侵襲，并引起G2/M期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能與其下調(diào)Cyclin B1、CDK1、Bcl-2、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，以及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。這將為CDM用于治療腎癌提供新的理論依據(jù)。