聚乙二醇2000/磷酸氫二鉀雙水相體系萃取溶菌酶

呂曉萌，鮑宗源，郝曉妤，布振乾，梁悅姿

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江哈爾濱 150000）

雙水相萃取 （Aqueous Two-phase Extraction，ATPS） 技術(shù)[1]，又稱為水溶液兩相分配技術(shù)（Partition of two aqueous system）是近年出現(xiàn)的、極有應(yīng)用前途的新型生物化工分離技術(shù)。它是利用雙水相的成相現(xiàn)象及待分離物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行物質(zhì)分離與純化的技術(shù)，即當(dāng)2種聚合物或一種聚合物與一種鹽在水中以一定濃度混合時(shí)，可形成互不相溶的兩相，其中一相富含一種聚合物，一相富含另一種聚合物或鹽，這種兩相體系稱之為雙水相體系 （Aqueous Two-phase systems，ATPS）[2]。

雙水相萃取技術(shù)的第一次應(yīng)用是在20世紀(jì)60年代，1956年瑞典倫德大學(xué)Albertsson首次應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)成功分離了葉綠素[3]，1979年德國(guó)國(guó)家生物工程研究中心（GBF） 的Kula等人應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)分離了生物酶。隨后，雙水相萃取技術(shù)因其操作條件比較溫和、產(chǎn)品活性損失少、具有較好的可調(diào)性、易于工藝放大和連續(xù)操作等特點(diǎn)，在蛋白質(zhì)、核酸和病毒的分離和純化中得到廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器

T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；SC-3610型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；AUY120型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器公司產(chǎn)品；A110280型渦流混勻器，南京稼竣生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

聚乙二醇2000（C.P），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；考馬斯亮藍(lán)G-250（H.S），中國(guó)惠世生化試劑有限公司提供；磷酸氫二鉀（A.R），天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供；磷酸（85%） （A.R），天津市耀華化學(xué)試劑有限公司提供；溶菌酶，北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 相圖的繪制

采用濁點(diǎn)法[2]繪制雙水相相圖。

1.3.2 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

考馬斯亮藍(lán)溶液的配制：將100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶解在50 mL（95%） 乙醇中，加入100 mL 85%（W/V）的濃磷酸，最后加超純水定容至1 000 mL，混勻后用雙層濾紙過濾，棕色瓶避光保存。

溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：配制一定濃度梯度的溶菌酶溶液，以每管中溶菌酶的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并作線性回歸，求線性方程。

1.3.3 雙水相體系的構(gòu)建

在10 mL玻璃離心管中，依次加入5 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 2000溶液、3 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的K2HPO4溶液和2 mL一定濃度的溶菌酶，總體積為10 mL，最后加入一定質(zhì)量的NaCl固體；充分搖勻后，置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心20 min，讀取上下相體積，使用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)上下相溶菌酶含量。

1.3.4 雙水相體系上下相溶菌酶含量的測(cè)定

使用考馬斯亮藍(lán)法[4]測(cè)定上下相溶菌酶含量?？赏ㄟ^測(cè)定波長(zhǎng)595 nm處的吸光度計(jì)算溶菌酶濃度。

1.3.5 雙水相體系計(jì)算公式

式中：V上——上相體積，mL；

V下——下相體積，mL；

C上——上相中溶菌酶質(zhì)量濃度，mg/mL；

C下——下相中溶菌酶質(zhì)量濃度，mg/mL；

C——溶菌酶質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——相體積，mL；

C0——加入溶菌酶質(zhì)量濃度，mg/mL；

V0——加入溶菌酶體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相相圖的繪制

PEG 2000/K2HPO4雙水相體系相圖見圖1。

從圖1可以看出，PEG 2000和K2HPO4可以很容易成相。

圖1 PEG 2000/K2HPO4雙水相體系相圖

2.2 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖2可以看出，回歸方程為Y=5.2499X+0.0396，R2=0.982，線性良好，可以用于測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)含量。

2.3 影響雙水相體系萃取溶菌酶因素的探究

2.3.1 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配效果的影響

K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響見圖3。

圖3 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響

從圖3可以看出，當(dāng)雙水相體系中PEG 2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變?yōu)?5%時(shí)，隨著K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，萃取率變化很小，這說明K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溶菌酶在雙水相體系中的分配影響較小。

2.3.2 PEG 2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配效果的影響

PEG 2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響見圖4。

圖4 PEG2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響

從圖4可以看出，溶菌酶主要富集在上相，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，萃取率隨著PEG 2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而變大，當(dāng)PEG 2000達(dá)到45%時(shí)，萃取率有所下降。由于溶菌酶主要分配在上相，PEG 2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，體系黏度增加，因而相間分子轉(zhuǎn)移的阻力也增加，隨著PEG 2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，萃取率隨之降低。所以，PEG 2000最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%（W/W）。

2.3.3 溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)分配效果的影響

溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響見圖5。

圖5 溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響

從圖5可以看出，溶菌酶的萃取率剛開始會(huì)有所上升，但隨著溶菌酶質(zhì)量濃度的增加，萃取率會(huì)有所下降。

2.3.4 NaCl用量對(duì)分配效果的影響

不同NaCl用量對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響見圖6。

從圖6可以看出，體系中NaCl用量達(dá)到0.2 g時(shí)，溶菌酶在上相的富集達(dá)到上限，即上相溶菌酶萃取率不再隨NaCl用量的增加而升高。所以，NaCl 0.2 g/10 mL更有利于溶菌酶的萃取。

圖6 不同NaCl用量對(duì)體系上相溶菌酶萃取率的影響

3 結(jié)論

（1） 在PEG 2000/K2HPO4雙水相體系萃取溶菌酶的眾多因素中，其中影響最大的是PEG 2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溶菌酶萃取率的影響不大。

（2）不同溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)萃取率也有影響。

（3）NaCl用量對(duì)溶菌酶萃取率影響較大。

（4）PEG 2000/K2HPO4雙水相體系對(duì)溶菌酶能夠達(dá)到較好的萃取能力。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%（W/W）磷酸氫二鉀3 mL，45%（W/W） PEG 2000 5 mL，質(zhì)量濃度1 mg/mL溶菌酶2 mL，NaCl用量為0.2 g/10 mL時(shí)，溶菌酶主要分配在雙水相體系的上相，相比為1，分配系數(shù)為6.53，萃取率為75.3%。