小龍蝦疾病的病原檢測

宮子慧

近年來，克氏原螯蝦（俗稱小龍蝦）的消費量不斷增加，人工養(yǎng)殖面積持續(xù)擴大，泗洪縣小龍蝦的養(yǎng)殖模式主要以稻蝦綜合種養(yǎng)為主。2018年5月起，我縣部分養(yǎng)殖戶的小龍蝦出現(xiàn)死亡，病蝦主要表現(xiàn)為頭胸甲易剝離、肝胰腺顏色淡黃、螯肢及附肢無力、反應(yīng)遲鈍、應(yīng)激能力較弱、在頭胸甲部位常出現(xiàn)白斑。筆者通過對病蝦肝胰腺的細菌分離及鑒定，和PCR法分子檢測技術(shù)來探討引起小龍蝦發(fā)病的原因。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

病蝦樣本來自泗洪縣青陽鎮(zhèn)、曹廟鄉(xiāng)、孫園鎮(zhèn)、城頭鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)的6個發(fā)病的養(yǎng)殖塘口，樣本的采樣編號、采集時間及地點見表1。

表1 小龍蝦病樣采集信息

表2 鑒定試劑條檢測結(jié)果

表3 2株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對照表 mg/L

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗

用滅菌棉簽蘸取小龍蝦肝胰腺，均勻涂于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上和TCBS培養(yǎng)基上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h后，觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個菌落劃線接種在營養(yǎng)瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h。

挑取純化過的細菌制成0.5麥氏單位的菌懸液，采用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）系統(tǒng)測定各分離菌株生理生化特性，同時做氧化酶反應(yīng)構(gòu)成第21個試驗，并用南京菲恩醫(yī)療科技有限公司的動物用藥敏分析試劑板進行藥敏試驗。

1.2.2 WSSV 核酸提取及檢測

從病蝦中取約100mg鰓組織，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒的說明進行DNA提取，對WSSV DNA樣本采用《GB /T 28630.2-2012白斑綜合征（ WSD）診斷規(guī)程第2部分套式PCR 檢測法》為標準進行檢測。PCR擴增體系總量為50μL，分別為：25μL Mix Taq酶（ Takara），18μL無菌水，1 μL正向引物，1 μL反向引物，5μL模板。PCR產(chǎn)物通過用50×TAE電泳緩沖液配制的1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

圖 3 WSSV PCR檢測結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 病原菌的鑒定藥敏試驗

從小龍蝦肝胰腺分離到的細菌在營養(yǎng)瓊脂平板上為光滑、濕潤、微凸、淡黃色菌落，在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落。對分離的2株細菌進行生理生化檢測，結(jié)果判定：分別為嗜水氣單胞菌和霍亂弧菌，具體生理生化特性見表 2。

2.2 病原菌的藥敏試驗結(jié)果

2株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表3所示。

參照2013年抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，嗜水氣單胞菌對紅霉素為耐藥，對其他7種抗菌藥物均敏感，霍亂弧菌對紅霉素為中敏，對其他7種抗菌藥物均敏感。

2.3 WSSV PCR檢測結(jié)果

PCR檢測結(jié)果顯示病蝦WSSV病毒陽性檢出率為100%，如圖3所示。

M∶DNA Marker（自上到下依次為2000、1000、750、500、250、100bp）；1.陽性對照；2.陰性對照；3.采樣編號SH18050301；4.采樣編號4SH18050302；5.采樣編號SH18050303；6.采樣編號SH18050304；7.采樣編號SH18060601；8.采樣編號SH18060602

3 討論與分析

從生病小龍蝦肝胰腺分離到的2個細菌，根據(jù)其培養(yǎng)后的菌體形態(tài)特征、生化特性分析結(jié)果，分別確定為嗜水氣單胞菌和霍亂弧菌。通過藥敏試驗表明兩種菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強力霉素均敏感。

PCR結(jié)果表明所有小龍蝦中都感染了WSSV（白斑綜合征病毒）。WSSV為一種無包涵體病毒，地理分布廣，流行范圍大，傳染性強，對發(fā)病蝦致死時間短，目前尚無有效的治療藥物，還不能有效地控制疫情，因此在小龍蝦養(yǎng)殖過程中應(yīng)加強疾病的預(yù)防?？刂坪侠淼姆琶缑芏龋?guī)格200尾左右/kg的蝦苗畝均放養(yǎng)量不超過30kg，苗種健康，養(yǎng)殖過程中加強飼料投喂，提早投喂精飼料，顆粒飼料蛋白含量36%以上，提高蝦的抗病力，調(diào)控好水質(zhì)，定期潑灑氯制劑或碘制劑進行水體消毒，移植培育好水草，營造良好的池塘環(huán)境，同時每7-10天使用過硫等底改產(chǎn)品改善養(yǎng)殖池底環(huán)境，定期內(nèi)服黃芪多糖等增強免疫力的產(chǎn)品。如果在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)死蝦，應(yīng)認真處理好死亡的病蝦，在遠離養(yǎng)殖塘處掩埋病蝦，杜絕病毒的進一步擴散。