草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶和AChE酶活性的影響

王冰潔 姜蕾 潘波 劉迎 林勇

摘 ?要??蚯蚓是土壤健康的關(guān)鍵指示生物，為了更好地評(píng)價(jià)草甘膦對(duì)土壤無(wú)脊椎動(dòng)物的影響，本研究采用土壤法測(cè)定草甘膦對(duì)蚯蚓的急性毒性;用不同濃度的草甘膦分別測(cè)定不同暴露時(shí)間下對(duì)蚯蚓超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶活性的影響。結(jié)果顯示，土壤法測(cè)定草甘膦對(duì)蚯蚓的LC₅₀>1000?mg/kg;在草甘膦的影響下，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，蚯蚓SOD酶活力有著先增高后下降的趨勢(shì)，CAT酶活力呈現(xiàn)著先下降后升高的趨勢(shì)，隨著時(shí)間和濃度的增長(zhǎng)POD酶活力在草甘膦的影響下有逐漸下降的趨勢(shì);相對(duì)于空白對(duì)照，處理組AChE酶活力在草甘膦暴露14 d時(shí)顯著降低。研究結(jié)果將為合理評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)草甘膦造成的土壤污染水平提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?草甘膦;蚯蚓;急性毒性;酶活力中圖分類號(hào)??X171.5??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Effect of Glyphosate on the Activities of Antioxidase Enzymes and Acetylcholinesterases in Vivo?Earthworm

WANG Bingjie^1，2， JIANG Lei^1，2*， PAN Bo^1，2， LIU Ying^1，2， LIN Yong^1，2*

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2.?Key Laboratory of Integrated Pest Management of Tropical Crops， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?Earthworm （Eisenia fetida） is one of the key bio-indicators of soil health. To evaluate the effects of glyphosateon soil invertebrates， the acute toxicity of glyphosate to earthworms were determined by artificial soil test. Effects of different concentrations of glyphosate on the activities of superoxidedismutase （SOD）， catalase （CAT）， peroxidase （POD）， glutathions S-transferase （GST） and acetylcholinesterase （AChE） in earthworms were measured at different exposure durations. The results of artificial soil test showed that theLC₅₀of glyphosate to earthworms was greater than 1000 mg/kg （7 d， 14 d）， indicating that the acute toxicity of glyphosate was low to earthworms. With the increase of glyphosate concentrations and exposure time， the activity of SOD in earthworms increased first and then decreased; the activity of CAT in earthworms decreased first and then increased; and the activity of POD in earthworms kept decreasing. Compared to the control， the activity of AChE in earthworms exposed to glyphosate reduced significantly after 14 days. The results would provide a scientific basis for rational evaluation and monitoring of soil pollution level caused by glyphosate.

Keywords ?glyphosate; earthworm; acute toxicity; enzyme activity

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.019

草甘膦屬內(nèi)吸傳導(dǎo)廣譜滅生性除草劑，對(duì)多年生深根性雜草地下組織有很強(qiáng)的破壞能力，能直接殺死雜草的根系，在抑制農(nóng)地雜草、保護(hù)農(nóng)作物生長(zhǎng)方面發(fā)揮了巨大的作用，是目前世界上使用量最大的除草劑，廣泛用于防除一年生和多年生雜草^[1-3]。伴隨著草甘膦的大量使用，源源不斷的草甘膦進(jìn)入土壤;有研究表明，進(jìn)入土壤中的農(nóng)藥一方面通過(guò)淋溶作用向下遷移進(jìn)入地下水造成水污染，另一方面通過(guò)作物根部吸收進(jìn)入農(nóng)作物，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育造成脅迫，影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而為害人類健康^[4-8]。

蚯蚓作為土壤環(huán)境中主要的動(dòng)物類群，對(duì)維持土壤肥力起到重要作用，更是生態(tài)系統(tǒng)健康與否的重要指示生物。有大量文獻(xiàn)表明研究農(nóng)藥對(duì)蚯蚓行為的影響對(duì)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義^[9]。農(nóng)藥污染物對(duì)蚯蚓在個(gè)體、細(xì)胞和分子等不同生命層面都會(huì)產(chǎn)生毒理學(xué)作用。研究表明，草甘膦對(duì)蚯蚓的急性毒性較低，其LC₅₀值為6.3?mg/mL，屬低毒級(jí)^[10]，并且有研究表明，草甘膦在土壤中濃度為996 ?g/kg時(shí)，對(duì)蚯蚓沒(méi)有影響^[11]。

除草劑可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)^[12]，而蚯蚓體內(nèi)有一系列的氧化防御機(jī)制，如抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）^[13]，其中GST也可參與解毒代謝^[14];蚯蚓乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的變化是農(nóng)藥暴露研究的生物標(biāo)志物之一^[15-16]。

本研究以蚯蚓為主要實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)土壤法研究除草劑草甘膦對(duì)蚯蚓的毒性和致死效應(yīng);并進(jìn)一步研究蚯蚓超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）和乙酰膽堿酯酶（AChE）活力在不同濃度草甘膦作用下的變化，研究結(jié)果將為科學(xué)地評(píng)價(jià)農(nóng)藥安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1??材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?供試動(dòng)物?赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia fetida）購(gòu)自天津成功蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)，購(gòu)置的蚯蚓以發(fā)酵的牛糞經(jīng)滅菌后作為飼料，于室溫（20～25?℃）下飼養(yǎng)。選用環(huán)帶明顯、體重為300～500 mg的成熟健康蚯蚓作為測(cè)試材料。實(shí)驗(yàn)前先把預(yù)培養(yǎng)的蚯蚓用蒸餾水洗干凈，放在有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，使蚯蚓清腸、吐泥24 h^[17]。

1.1.2 ?供試土壤??實(shí)驗(yàn)土壤采用人工土壤：68%的石英砂、20%的高嶺土、10%的泥炭蘚、2%碳酸鈣，調(diào)節(jié)pH為6.0±0.5，各組分總質(zhì)量為500?g。

1.1.3 ?供試藥品和試劑 ?草甘膦原藥（95%），麥克林公司;酶活性檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所;其他試劑均購(gòu)于西隴化工有限公司。

1.2方法

1.2.1??人工土壤法毒性實(shí)驗(yàn)??急性毒性實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置草甘膦染毒土壤濃度為0、200、400、600、800、1000 mg/kg。染毒方法按照化學(xué)品對(duì)蚯蚓毒性試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 21809-2008）進(jìn)行，將500 g人工土壤放入1 L的燒杯中加入175 mL用去離子水溶解的草甘膦，充分混勻使其達(dá)到所設(shè)定的濃度，同時(shí)設(shè)水為空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。然后將10條清腸24 h的健康蚯蚓放入染毒土壤的燒杯中，用紗布封口，防止蚯蚓逃逸。將蚯蚓放入人工氣候箱內(nèi)[溫度（20±1）℃，濕度80%±2%，光照強(qiáng)度為800 lx，光暗比14 h∶10 h]培養(yǎng)，分別在第7天和第14天觀察記錄蚯蚓的死亡數(shù)。

1.2.2 ?草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)酶活性的影響 ?為了進(jìn)一步了解除草劑草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的毒性效應(yīng)，采用人工土壤法研究了草甘膦脅迫對(duì)赤子愛(ài)勝蚓氧化防御系統(tǒng)酶SOD、CAT、POD 活性及谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響。根據(jù)草甘膦田間使用量和急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置6個(gè)濃度，分別為0、2、10、50、150、450 mg/kg，實(shí)驗(yàn)條件和方法同1.2.1節(jié)，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。分別在培養(yǎng)第3、7、14、21 天隨機(jī)從每份土壤中取出2條蚯蚓用于酶活性測(cè)定，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未見(jiàn)蚯蚓死亡。

粗酶液的提取和蛋白含量的測(cè)定：將清腸24?h的蚯蚓用去離子水洗凈，吸干水分，稱重，放入預(yù)冷的25 mL玻璃勻漿器中，然后加入9倍體積預(yù)冷的生理鹽水，冰浴研磨成10%的組織勻漿，在-80?℃的超低溫冰箱中保存，以備SOD、POD、CAT、GST和AChE活性測(cè)定。蛋白含量采用Bradford^[18]的方法測(cè)定，以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在595 nm下測(cè)定樣品的吸光度。SOD、CAT、POD、GST和AChE活性的測(cè)定均按照南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD），利用單因素方差分析法（one-way ANOVA）中post hoc-LSD法進(jìn)行對(duì)照組和濃度組之間的差異顯著性分析，并用GraphPad Prism 7軟件繪圖。

2??結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對(duì)蚯蚓急性毒性

在實(shí)驗(yàn)的第7、14天檢查死亡率，發(fā)現(xiàn)對(duì)照和處理組均沒(méi)有出現(xiàn)蚯蚓死亡現(xiàn)象，即研究結(jié)果顯示LC₅₀>1000 mg/kg。

2.2草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

2.2.1??對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD活性影響 ?草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓SOD活性影響如圖1所示，在暴露第3天和第7天時(shí)各濃度草甘膦處理組SOD酶活性均顯著高于空白對(duì)照組，暴露第3天時(shí)濃度為50?mg/kg草甘膦處理的酶活力最高，較對(duì)照提高了25.48%。暴露第7天時(shí)，與對(duì)照相比，濃度為10、150、450 mg/kg處理時(shí)蚯蚓體內(nèi)SOD活性顯著提高（P<0.01），分別提高了40.18%、38.76%和40.03%。在10、50、150和450 mg/kg濃度下暴露第14天時(shí)，蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性顯著下降，分別較對(duì)照下降了41.12%、34.47%、39.48%和43.62%。在暴露第21天時(shí)各濃度草甘膦處理組與空白對(duì)照組均無(wú)顯著差異。

2.2.2??對(duì)蚯蚓體內(nèi)CAT活性影響??草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓CAT活性影響如圖2 所示，在暴露第3天時(shí)只有濃度為2 mg/kg草甘膦處理的CAT活性顯著高于空白對(duì)照組。暴露第7天時(shí)，各濃度草甘膦處理組CAT活性均顯著高于空白對(duì)照組，分別提高了33.64%，73.89%、36.61%、45.16%和60.77%，其中濃度為10 mg/kg草甘膦處理組的CAT酶活力最高。暴露第14天時(shí)，只有濃度為10 mg/kg時(shí)CAT活性顯著增高，提高了76.21%。在暴露第21天時(shí)各濃度草甘膦處理組與空白對(duì)照組均無(wú)顯著差異。

2.2.3??對(duì)蚯蚓體內(nèi)POD活性影響??草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓POD活性影響如圖3所示，在暴露第3天和第7天時(shí)各濃度草甘膦處理組與空白對(duì)照組均無(wú)顯著差異。暴露第14天時(shí)草甘膦濃度為50和450 mg/kg的處理組POD酶活力降低，分別較對(duì)照下降了16.83%和35.76%。暴露第21天時(shí)，濃度為150和450 mg/kg草甘膦處理組酶活力降低，分別較對(duì)照下降了22.69%和21.60%。

2.2.4??對(duì)蚯蚓體內(nèi)GST活性影響??草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓GST活性影響如圖4所示，在暴露第3天時(shí)，草甘膦濃度為2、50、150和450 mg/kg的處理組CAT酶活力顯著低于空白對(duì)照組，分別降低了29.64%、14.87%、29.07%和36.29%，濃度為450 mg/kg草甘膦處理組GST酶活力最低。暴露第7天時(shí)，濃度為50和450 mg/kg草甘膦處理組GST酶活性顯著低于空白對(duì)照組，分別下降了36.52%和44.10%。暴露第14天時(shí)，各濃度草甘膦處理組GST酶活性均顯著低于空白對(duì)照組，分別下降了35.75%、47.95%、68.76%、57.93%和64.13%。暴露第21天時(shí)，濃度為50、150和450?mg/kg的草甘膦處理組GST酶活性均顯著低于空白對(duì)照組，分別下降了46.58%、70.35%和73.63%。

2.2.5??對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE活性影響??草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓AChE活性影響如圖4所示，在暴露第3天和第7天時(shí)，只有在草甘膦濃度為150 mg/kg的處理組AChE酶活性顯著低于空白對(duì)照組，分別降低了48.31%和29.46%。暴露第14天時(shí)，各濃度草甘膦處理組AChE酶活性均顯著低于空白對(duì)照組，分別下降了16.89%、34.43%、43.33%、35.63%和49.64%。在暴露第21天時(shí)各濃度草甘膦處理組AChE活性與空白對(duì)照組均無(wú)顯著差異。

3??討論

蚯蚓急性毒性研究在蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究中具有重要的意義，通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)可以得出化學(xué)品對(duì)蚯蚓直接致死率與劑量之間的關(guān)系，明確化學(xué)品對(duì)蚯蚓的毒性等級(jí)^[19]。人工土壤法測(cè)定蚯蚓毒性實(shí)驗(yàn)，模擬了蚯蚓的生活環(huán)境，可為化學(xué)品對(duì)蚯蚓的毒性評(píng)價(jià)提供較為準(zhǔn)確的結(jié)果^[20]。根據(jù)國(guó)家蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用人工土壤法測(cè)定了草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的急性毒性。研究結(jié)果顯示草甘膦原藥在第7天和第14天時(shí)對(duì)蚯蚓的LC₅₀大于1000 mg/kg，屬于低毒級(jí)，該研究結(jié)果與Wang等^[21]的報(bào)道相一致。

本研究中，在暴露第3天和第7天時(shí)各濃度草甘膦處理組SOD酶活性均顯著高于空白對(duì)照組。第3天，50?mg/kg草甘膦濃度時(shí)SOD酶活性為最高，而后活性降低，說(shuō)明暴露第3天時(shí)，蚯蚓產(chǎn)生了明顯的應(yīng)激反應(yīng)。而暴露14 d時(shí)，在10、50、150和450 mg/kg濃度下，蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性顯著下降。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增大，SOD酶活性均呈現(xiàn)先增高再降低的趨勢(shì)。前期SOD活性增強(qiáng)的原因可能是為了維持機(jī)體自身的氧化平衡，蚯蚓體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)被激活，刺激SOD的合成來(lái)清除過(guò)多的氧自由基，而后出現(xiàn)下降的原因可能是蚯蚓機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞，機(jī)體受損程度增強(qiáng)，體內(nèi)的自穩(wěn)機(jī)制被打亂，而導(dǎo)致SOD酶活力下降^[22-23]。該結(jié)果與已有研究中草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的影響隨濃度和時(shí)間遞增整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)相符^[24-25]。然而也有研究表明水生生物凱氏小球藻（Chlorella kessleri）暴露于40～70 mg/L草甘膦時(shí)SOD活性顯著提高，未發(fā)現(xiàn)SOD活性顯著下降現(xiàn)象^[26]。

CAT和POD可以有效地協(xié)同將SOD歧化自由基產(chǎn)生的過(guò)氧化氫分解，從而消除其對(duì)生物體的氧化毒害^[27]。在本研究中，暴露第3天和第7天時(shí)，草甘膦脅迫下蚯蚓體內(nèi)CAT活性顯著高于空白對(duì)照，而之后與對(duì)照無(wú)顯著差異（圖2）。而草甘膦脅迫下的POD活性在暴露前期與對(duì)照無(wú)顯著，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，在第14天和第21天，高濃度脅迫下POD活性顯著低于空白對(duì)照（圖3）。這可能是由于隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，因草甘膦降解而生物有效性降低，對(duì)蚯蚓的氧化脅迫逐漸減少，CAT活性逐漸恢復(fù)至對(duì)照水平，POD則繼續(xù)承擔(dān)清除高濃度草甘膦脅迫下蚯蚓體內(nèi)H₂O₂的任務(wù)，大量POD被消耗從而表現(xiàn)出酶活性持續(xù)低于對(duì)照水平的現(xiàn)象。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓在被草甘膦污染的土壤中暴露7 d后，對(duì)過(guò)氧化氫酶（CAT）活性無(wú)顯著影響^[25]，但與本研究結(jié)果一致的是在暴露第14天和第21天CAT活性逐漸恢復(fù)至對(duì)照水平;而在21 d時(shí)，空白對(duì)照組SOD明顯降低，POD活性明顯提高，是由于人工土壤中未添加其他食物，導(dǎo)致蚯蚓生命活力降低，產(chǎn)生更多的氧自由基，SOD消耗歧化自由基產(chǎn)生過(guò)氧化氫，為維持機(jī)體平衡，POD酶活力增高來(lái)清除蚯蚓體內(nèi)的H₂O₂。

本研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦處理后顯著降低了GST酶活力（圖4）。有研究顯示，草甘膦處理28 d后，Octolasioncyaneum GST活性被抑制^[28]，然而在草甘膦暴露24 h和98?d后，條紋鯪脂鯉（Prochilodus lineatus）GST活性升高^[29]。然而空白對(duì)照組蚯蚓GST酶活力也會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，蚯蚓生命活力降低，為保護(hù)蚯蚓免受氧化損傷，消耗GST酶來(lái)清除體內(nèi)的脂類過(guò)氧化物^[30]。本研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對(duì)蚯蚓AChE酶活力有抑制作用，這可能歸因于草甘膦屬于有機(jī)磷類除草劑，其作用機(jī)理是抑制膽堿酯酶活性，膽堿酯酶失去分解乙酰膽堿的能力，導(dǎo)致乙酰膽堿在體內(nèi)積蓄過(guò)多而中毒^[31];而乙酰膽堿酯酶活性的變化與氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的變化有關(guān)^[32-33]，研究結(jié)果與宋欣媛等^[24]和Hac kenberger等^[25]報(bào)道一致。

本研究結(jié)果表明草甘膦對(duì)赤子愛(ài)勝蚓低毒。在受試濃度范圍草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD、CAT、POD、GST和AChE活性均有不同程度影響，但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，14 d后草甘膦對(duì)蚯蚓的氧化脅迫基本消失，說(shuō)明供試濃度內(nèi)草甘膦不會(huì)對(duì)蚯蚓造成明顯的氧化損傷。本研究?jī)H確定了草甘膦原藥對(duì)蚯蚓的急性毒性和短期內(nèi)氧化脅迫的影響，但草甘膦農(nóng)藥制劑復(fù)雜，商品農(nóng)藥中的助劑或其他成分也可能比草甘膦活性成分對(duì)蚯蚓有更大的毒性作用^[34-35]，并且有研究表明，長(zhǎng)期使用草甘膦除草劑的土壤中發(fā)現(xiàn)蚯蚓種類、密度和生物量均減少^[36]。所以進(jìn)一步研究草甘膦慢性毒性對(duì)蚯蚓本地物種的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響，可以更好地了解其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響。

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