橡膠樹多主棒孢病菌Cassiicolin基因條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建及分子檢測(cè)技術(shù)

李博勛 劉先寶 馮艷麗 解惠婷 黃貴修

摘 ?要??多主棒孢（Corynespora cassiicola）是為害我國主要熱帶作物的植物病原真菌，其寄主范圍廣、形態(tài)差異顯著、癥狀類型多樣，且含有一種寄主?；远舅谻assiicolin，存在6種毒素類型。本研究利用已公布的Cassiicolin毒素基因（Cas1～Cas6型），構(gòu)建了含287個(gè)菌株的國內(nèi)橡膠樹和部分熱帶作物多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數(shù)據(jù)庫，建立了一套特異性強(qiáng)、靈敏度高的分子檢測(cè)技術(shù)，可檢測(cè)100 pg/μL的目標(biāo)基因組DNA，系統(tǒng)分析了我國橡膠樹、木薯、番木瓜、瓜菜等主要熱帶作物的919株多主棒孢的毒素類型，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)僅存在Cas2和Cas5這2種毒素類型，其中Cas5型的菌株占94.8%，為橡膠樹多主棒孢的優(yōu)勢(shì)種群和特有毒素類型。而Cas2型是橡膠樹和其他作物多主棒孢共有的毒素型。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，不同毒素類型的多主棒孢菌株與寄主來源密切相關(guān)，但與地理來源沒有明顯的相關(guān)性，且Cas5型多主棒孢具有明顯的寄主?；浴Ｍㄟ^構(gòu)建多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數(shù)據(jù)庫，為明確我國主要熱帶作物多主棒孢病菌的種群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)種群情況，發(fā)掘、保存多主棒孢菌種資源以及制定病害的防治策略上具有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 ?多主棒孢;Cassiicolin毒素基因;DNA條形碼;分子檢測(cè)中圖分類號(hào)??S763.7??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Construction of Cassiicolin Genes Barcode Database and Molecular Detection Technology of Corynespora cassiicola?from Hevea brasiliensis?in China

LI Boxun， LIU Xianbao， FENG Yanli， XIE Huiting， HUANG Guixiu^*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?Corynespora cassiicolais a plant pathogenic fungus， which is harmful to major tropical crops in China. It has a wide range of hosts， significant morphological differences， diverse symptoms and contains a host-specific toxin， which encoding up to six distinct protein isoforms. In the study， we used public database to construct Cassiicolin genes barcode database ofC. cassiicolaform major tropical crops in China.?At the same time， we established a set of molecular detection techniques with high specificity and sensitivity， which could detect 100 pg/μL target genomic DNA. Then， we systematically detected the isoforms cassiicolin ofC. cassiicola， which were isolated from rubber tree， cassava， papaya， melon and vegetable in China. There were only two isoforms Cassiicolin in China， among which the Cas5 isoform Cassiicolin accounted for 94.8%， and had obvious host specificity and was specific and advantage population on rubber tree in China. Phylogenetic tree analysis showed that distinct isoforms Cassiicolin ofC. cassiicolawas closely related to host origin， but not to geographical origin. The results of the research would significantly contribute to the population genetic structure， dominant population， preservation ofC. cassiicolaand control strategies.

Keywords ?Corynespora cassiicola; Cassiicolin genes; DNA barcoding; molecular detection

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.015

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一種重要的植物病原真菌，其寄主范圍十分廣泛，可侵染為害熱帶地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)作物（橡膠樹、木薯）、瓜菜、果樹和花卉等，生理小種復(fù)雜，侵染破壞力極強(qiáng)，病斑類型多樣，具有豐富的遺傳多種樣性^[1-4]。該菌含有特別的寄主?；远舅谻assiicolin，是一種新型結(jié)構(gòu)的毒素蛋白，這也是該菌最主要的致病因子，存在6種毒素類型^[5]。Atan等^[6]通過致病譜差異確定了橡膠樹多主棒孢可能存在2個(gè)生理小種，結(jié)合RAPD、rDNA-RFLP和ISSR標(biāo)記可將2個(gè)生理小種在遺傳學(xué)方面進(jìn)行有效區(qū)分，Shukor等^[7]推測(cè)，在橡膠樹上可能存在第3個(gè)生理小種，但至今仍未明確多主棒孢的生理小種?，F(xiàn)有研究表明，多主棒孢的遺傳進(jìn)化支與寄主來源密切相關(guān)，但與其形態(tài)特征、致病性、地理來源以及品種（系）之間沒有明顯的相關(guān)性。Déon等^[8]通過Cassiicolin毒素基因、ITS、ga4、caa5，以及act1基因序列對(duì)不同寄主植物和地理來源多主棒孢分離物的多樣性進(jìn)行了分析，其中47%供試分離物中檢測(cè)到Cassiicolin編碼基因，可編碼6種不同類型的蛋白質(zhì)，通過定義的Cassiicolin毒素類型使聚類分析結(jié)果更加清晰明了。劉先寶等^[9]分析了國內(nèi)橡膠樹多主棒孢Cassiicolin毒素的多樣性與致病力分化之間的關(guān)系，初步獲得了橡膠樹上多主棒孢的主要毒素類型。因此，在多主棒孢的生理小種尚未確定的情況下，國際上常利用Cassiicolin基因編碼的6個(gè)毒素類型，來進(jìn)一步劃分多主棒孢病菌的致病型，這也是現(xiàn)階段研究多主棒孢分類的主要依據(jù)。

多主棒孢在我國分布較廣，為害的作物種類多，研究?jī)r(jià)值大。而傳統(tǒng)的鑒定方法常根據(jù)寄主、病斑類型、病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀等進(jìn)行區(qū)分，而多主棒孢病菌造成的病斑類型多樣，病原菌極容易變異，而且不同類型的多主棒孢菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀上存在一定的差異。而Cassiicolin毒素基因是多主棒孢基因組中一段公認(rèn)的、特有的、相對(duì)較短的DNA序列，能將多主棒孢與其他真菌進(jìn)行有效區(qū)分、精準(zhǔn)鑒定。為此，本研究擬構(gòu)建多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數(shù)據(jù)庫，利用該數(shù)據(jù)庫對(duì)國內(nèi)主要熱帶作物多主棒孢菌株進(jìn)行鑒定，明確病原菌的遺傳結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)種群，建立多主棒孢病菌的早期分子檢測(cè)技術(shù)。這對(duì)明確我國主要熱帶作物多主棒孢的種類組成，系統(tǒng)發(fā)育與寄主的多樣性關(guān)系，發(fā)掘、保存多主棒孢菌種資源以及制定病害的防治策略上具有重要意義。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?供試菌株??287株多主棒孢菌株（表1）以及用于分子檢測(cè)的其他病原菌菌株均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶工業(yè)原料作物病害研究組分離和保存，其中橡膠多主棒孢275株，其他寄主多主棒孢12株。NCBI數(shù)據(jù)庫下載的多主棒孢Cassiicolin基因信息（表2）。

1.1.2??培養(yǎng)基與試劑??PDA培養(yǎng)基參照《植病研究方法》配制^[10]，用于多主棒孢菌株的培養(yǎng)。引物（表3）均由華大基因股份有限公司合成;克隆載體pMD18-T、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑購于TAKARA公司;pMD18-T載體、TaqDNA聚合酶、dNTP等購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA Maker、Trans5α大腸桿菌感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 ?儀器與設(shè)備??Bio-Rad T100型梯度PCR儀，美國伯樂公司; UVI FireReader凝膠成像系統(tǒng)，英國UVItec公司。

1.2方法

1.2.1??DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序??采用CTAB方法^[11]提取病原菌DNA，用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA質(zhì)量測(cè)定，用Cassiicolin引物序列（表3）對(duì)病原菌目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件參照Déon等^[5]的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)Omega Bio-Tek試劑盒進(jìn)行目的條帶回收之后克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化Trans5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，送華大基因技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.2 ?序列分析、遺傳距離計(jì)算和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建??將序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，利用CodonCode Aligner V7.0.1去除測(cè)序峰圖的低質(zhì)量區(qū)域、完成峰圖校對(duì)拼接和引物序列切除，應(yīng)用PUAP 4.0軟件計(jì)算種內(nèi)、種間遺傳距離;利用MEGA7.0軟件最大似然法中的Tamura-Nei model構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3??分子檢測(cè)技術(shù)??用Cassiicolin引物對(duì)供試菌株的DNA進(jìn)行特異性檢測(cè)，通過優(yōu)化反應(yīng)體系中各試劑用量及退火溫度，建立PCR擴(kuò)增最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)體系加入量DNA（50 ng/μL）1 μL，特異引物對(duì)（10 pmol/μL）1 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.3 μL，ddH₂O 18.2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4?℃預(yù)變性3 min，94?℃變性45 s，57?℃退火45 s，72?℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72?℃延伸完全10 min，4?℃下保存。將供試菌株的DNA濃度分別稀釋為30 ng/μL、20?ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL，按照上述反應(yīng)條件和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以ddH₂O作為陰性對(duì)照。

2??結(jié)果與分析

2.1多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

根據(jù)菌株地理來源、寄主、年份和毒素類型等信息，挑選了287株代表性菌的Cassiicolin基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了國內(nèi)主要熱帶作物多株棒孢的Cassiicolin條形碼數(shù)據(jù)庫（表1）?；贜CBI公共數(shù)據(jù)庫已公布的多主棒孢Cassiicolin基因信息，分別使用BLAST方法和MJ系統(tǒng)發(fā)育樹法與NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的多主棒孢Cassiicolin條形碼序列進(jìn)行比對(duì)，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試的多主棒孢菌株與NCBI已公布的多主棒孢Cassiicolin序列同源性均高達(dá)99%，第Ⅰ大類群是Cas5型，均為橡膠樹多主棒孢，主要來源于云南、海南、廣東、廣西等國內(nèi)橡膠主產(chǎn)區(qū)，還有部分菌株來源于越南、柬埔寨、馬來西亞。第Ⅱ大類群是Cas2型，是橡膠和其他作物均有的多主棒孢，主要來源于橡膠樹、木薯、黃瓜、番木瓜、大豆、棉花等，不同寄主上的菌株親緣關(guān)系近，都聚類到一個(gè)分支上。從系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果可以看出，不同毒素類型的多主棒孢菌株與寄主來源密切相關(guān)，但與地理來源沒有明顯的相關(guān)性，且Cas5型的多主棒孢僅為橡膠樹所特有，為我國橡膠樹多主棒孢的優(yōu)勢(shì)種群。

2.2Cassiicolin毒素基因的分子檢測(cè)

本研究對(duì)我國橡膠主產(chǎn)區(qū)以及主要熱帶作物上分離保存的919株多主棒孢病菌進(jìn)行Cassiicolin毒素基因檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)我國多主棒孢病菌僅存在2種毒素類型，分別是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型的菌株占94.8%，為國內(nèi)橡膠樹主產(chǎn)區(qū)多主棒孢病菌的優(yōu)勢(shì)種群，且為橡膠樹所特有。而Cas2型是橡膠樹和其他作物（如：番木瓜、木薯、黃瓜等）多主棒孢共有的毒素類型，占3.2%。另一部分菌株未檢測(cè)到Cassiicolin毒素基因，定為Cas0型，占2%，在供試菌株中均未檢測(cè)到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株（圖2）。

用Cassiicolin（Cas5/Cas2）引物進(jìn)行特異性檢測(cè)，分別對(duì)殼梭孢（HNrMLXY1601）、茄類鐮刀菌（FsHHNBS04）、尖孢鐮刀菌（Foc4）、膠孢炭疽菌（Hbcg01）、尖孢炭疽菌（YN26-2）進(jìn)行分子檢測(cè)。從圖3和圖4的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果可以看出，Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R特異引物對(duì)僅能從供試多主棒孢菌株中擴(kuò)增到目的條帶，約750 bp，其他對(duì)照菌株和陰性對(duì)照均無任何擴(kuò)增產(chǎn)物，并且Cas5-F/Cas5-R引物僅能擴(kuò)增得到多主棒孢Cas5型毒素基因，Cas2-F/Cas2-R引物亦如此，具有唯一性說明這兩對(duì)引物對(duì)多主棒孢菌株有較強(qiáng)的特異性，可以用于多主棒孢病菌的分子檢測(cè)（圖3，圖4）。

用Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R進(jìn)行引物的靈敏度檢測(cè)，分別對(duì)Cas5型菌株HCcYN49和Cas2型菌株P(guān)aCcSD02進(jìn)行梯度擴(kuò)增，使其DNA濃度為30 ng/μL、20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)果顯示，

30?ng/μL～100 pg/μL濃度的多主棒孢病菌DNA均可擴(kuò)增到約750 bp的特征條帶，對(duì)照物無擴(kuò)增條帶，Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R均可以檢測(cè)到100 pg/μL及以上濃度的目標(biāo)基因組DNA，可用于多主棒孢病菌的快速檢測(cè)（圖5）。

左圖為特異引物Cas5-F/Cas5-R的擴(kuò)增結(jié)果，右圖為特異引物Cas2-F/Cas2-R的擴(kuò)增結(jié)果。

The left?picture is the amplification result of the specific primer Cas5-F/Cas5-R and the right one is the amplification result of the specific primer Cas2-F/Cas2-R.

1：30 ng/μL;2：20 ng/μL;3：10 ng/μL;4：5 ng/μL5：1 ng/μL;6：100 pg/μL;7：10 pg/μL;8：1 pg/μL;9：陰性對(duì)照（negative control）;M：DL2000 DNA marker。

3??討論

DNA條形碼是生物基因組中普遍存在的、較短的、標(biāo)準(zhǔn)化的DNA序列，它具有穩(wěn)定的種內(nèi)保守性，又包含足夠的種間遺傳變異，實(shí)現(xiàn)了對(duì)物種的快速而準(zhǔn)確的鑒定^[12]。相比于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，DNA條形碼技術(shù)不受個(gè)體發(fā)育階段、完整性等方面的影響，可以一次性快速鑒定大量的樣本，極大的促進(jìn)了生物分類學(xué)、生物多樣性以及分子系統(tǒng)學(xué)等領(lǐng)域的研究^[13]。Cassiicolin毒素基因是多主棒孢基因組中一段公認(rèn)的、特有的、相對(duì)較短的DNA序列，能將多主棒孢與其他真菌進(jìn)行有效區(qū)分，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定。在多主棒孢生理小種尚未定論的情況下，國際上常利用Cassiicolin基因編碼的6個(gè)毒素類型作為多主棒孢種內(nèi)和種間遺傳結(jié)構(gòu)、種群變化以及致病類型的主要依據(jù)^[14]。本研究基于Cassiicolin基因，構(gòu)建了含287個(gè)菌株的國內(nèi)主要熱帶作物多主棒孢基因條形碼數(shù)據(jù)庫，建立了多主棒孢早期分子檢測(cè)技術(shù)，分析了919株多主棒孢的毒素類型，發(fā)現(xiàn)我國多主棒孢病菌僅存在2種毒素類型，分別是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型為國內(nèi)橡膠樹主產(chǎn)區(qū)多主棒孢病菌的優(yōu)勢(shì)種群，且為橡膠樹所特有，而Cas2型是橡膠樹和其他作物（如：番木瓜、木薯、黃瓜等）多主棒孢共有的毒素類型。在供試的多主棒孢菌株中均未檢測(cè)到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株。據(jù)Déon等^[5]研究發(fā)現(xiàn)，Cas1型菌株主要是非洲國家橡膠樹和其他作物共有;Cas2和Cas6型菌株來源于國外其他寄主植物（非橡膠）;Cas3和Cas4型均來自巴西的橡膠樹內(nèi)生多主棒孢菌株;Cas5型菌株則來源于中國、馬來西亞、柬埔寨、斯里蘭卡等亞洲國家橡膠樹。盡管Cas5型為我國橡膠多主棒孢的優(yōu)勢(shì)種群，但Cas2型只有在我國的橡膠樹上發(fā)現(xiàn)，其他國家的Cas2型只有在非橡膠的其他寄主植物多主棒孢上存在。目前，有關(guān)多主棒孢Cassiicolin毒素類型與致病性之間的關(guān)系尚未得到廣泛的研究，尤其是毒素類型與寄主專化性、致病力強(qiáng)弱、生物學(xué)特性、形態(tài)學(xué)以及癥狀類型之間的關(guān)系值得在今后的研究中深入開展。另外，在多主棒孢生理小種尚未明確的情況下，Cassiicolin毒素基因有助于對(duì)多主棒孢潛在的種內(nèi)或種間遺傳進(jìn)化關(guān)系的解析，特別是那些還沒有確認(rèn)Cassiicolin毒素類型的Cas0型菌株，可能是多主棒孢新的種群。

DNA條形碼分析方法有5種^[12]，本研究采用了系統(tǒng)發(fā)育樹的分析方法，構(gòu)建了多主棒孢基因條形碼序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成了2個(gè)大的遺傳類群，分別是Cas5類群和Cas2類群，與分子檢測(cè)結(jié)果一一對(duì)應(yīng)，各分枝與毒素類型相一致。系統(tǒng)發(fā)育樹的DNA條形碼分析法在一定程度上反映了物種的親緣關(guān)系，但由于不完全譜系分類、祖先多態(tài)性及物種旁系同源性等原因，某些物種在系統(tǒng)發(fā)育樹上不能形成單系，但本研究構(gòu)建的多主棒孢Cassiicolin基因的系統(tǒng)發(fā)育樹沒有出現(xiàn)由于種內(nèi)遺傳距離小，在系統(tǒng)發(fā)育樹上常形成嵌套關(guān)系的現(xiàn)象。而且相比于其他幾種DNA條形碼的分析方法，系統(tǒng)發(fā)育樹法擺脫了遺傳距離閾值等影響，只考慮序列內(nèi)部的特征核苷酸，不涉及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在近緣種的鑒定上也表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。通過系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)橡膠多主棒孢單獨(dú)成為一個(gè)類群，與其他寄主的多主棒孢菌株存在明顯的差異，但不同地理來源的菌株間無明顯差異。致病力分化分析顯示^[9]，橡膠多主棒孢菌株不能侵染其他寄主，存在明顯的寄主?；袁F(xiàn)象，由于多主棒孢病菌寄主范圍廣，不同毒素類型結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致病原菌在致病性和寄主?；陨洗嬖诿黠@差異。

綜上所述，本研究首次構(gòu)建了國內(nèi)主要熱帶作物多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數(shù)據(jù)庫，建立了基于Cassiicolin基因的多主棒孢早期分子檢測(cè)技術(shù)，系統(tǒng)分析了我國橡膠樹、木薯、番木瓜、瓜菜等主要熱帶作物多主棒孢的毒素類型，明確了國內(nèi)多主棒孢的種群結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)種群和特有毒素類型。本研究為明確我國主要熱帶作物多主棒孢病菌的種群遺傳結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)種群情況，發(fā)掘、保存多主棒孢菌種資源以及制定病害的防治策略上具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

• 高 ?葦， 李寶聚， 石延霞. 多主棒孢菌在黃瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2011， 38（3）： 465-470.
• 高宏華， 羅大全， 黃貴修. 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病概述[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 28（5）： 19-24.
• 王??爽， 孔祥義， 林春花， 等. 豇豆輪紋病病原鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 32（5）： 61-65.
• 王??爽， 黃貴修， 李博勛， 等. 甜瓜棒孢葉斑病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（12）： 2446-2452.
• Déon M， Fumanal B， Gimenez S. Diversity of the Cassiicolin gene in Corynespora cassiicola， and relation with the pathogenicity in Hevea brasiliensis[J]. Fungal Biology， 2014，

118（1）： 32-47.

• Atan S， Hamid N H. Differentiating races of Corynespora cassiicola using RAPD and ITS markers[J]. Journal of Rubber Research， 2003， 6（1）： 58-64.
• Shukor N A A， Atan S， Derapi S， et al. Screening susceptibilty of Hevea?progenies from PB 5/51 XIAN 873 to two races of Corynespora cassiicola[J]. Journal of Rubber Research， 2011， 14（2）： 110-122.
• Déon M， Bourré Y， Gimenez S， et al. Characterization of a cassiicolin-encoding gene from Corynespora cassiicola， pathogen of rubber tree （Hevea brasiliensis）[J]. Plant Science， 2012， 185-186（4）： 227-237.
• 劉先寶， 李博勛， 陳??珊， 等. 國內(nèi)橡膠樹多主棒孢Cassiicolin毒素多樣性及致病性分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（10）： 1969-1973.
• 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998： 46.
• 劉先寶， 蔡吉苗， 潘羨心， 等. 橡膠樹多主棒孢菌rDNA-ITS區(qū)的分子鑒定及檢測(cè)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2008， 29（4）： 489-493.
• 楊倩倩， 劉蘇汶， 俞曉平. DNA條形碼分析方法研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2018， 29（3）： 1006-1014.
• Hebert P D N， Cywinska A， Ball S?L， et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society B， 2003， 270（1512）： 313-321.
• David L， Ribeiro S， Philippe L， et al. Genome-Wide analysis of Corynespora cassiicola?leaf fall disease putative effectors[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 276.