水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2的表型與等位基因序列分析

林秋云 丁西朋 謝振宇 賀治洲

摘 ?要??水稻穗頂部小穗退化在水稻生產(chǎn)中普遍存在，嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量。本文對水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2進(jìn)行表型觀察，同時(shí)測序分析突變體paa1-2中已報(bào)道的TUTOU1和PAA1基因序列。結(jié)果表明，突變體paa1-2穗頂部退化表型是在幼穗發(fā)育6期后產(chǎn)生的。突變體paa1-2和野生型的TUTOU1基因序列一致，然而其PAA1基因存在突變，在第1512～1515 bp處存在4個(gè)堿基缺失，導(dǎo)致基因移碼突變并使得蛋白翻譯提前終止，PAA1-2可能是已報(bào)道PAA1基因的新等位突變基因。

關(guān)鍵詞 ?水稻;穗頂部小穗退化突變體;paa1-2;表型;基因中圖分類號??S511.2+1??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Phenotype and Alleles Sequence Analysis of paa1-2， a Panicle Apical Abortion Mutant in Rice （Oryza sativa?L.）

LIN Qiuyun， DING Xipeng， XIE Zhenyu， HE Zhizhou

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?The molecular mechanism of panicle apical abortion has important theoretical and practical significance for high and stable yield breeding in rice （Oryza sativaL.）. The phenotype of a rice panicle apical abortion mutantpaa1-2was observed and theTUTOU1and?PAA1gene sequences in the mutantpaa1-2were sequenced. Results showed that the degraded phenotype of the mutantpaa1-2at the top of panicle was produced after the 6th stage of early panicle differentiation. TheTUTOU1 gene sequence in the mutant?paa1-2 was identical to that of wild type. However， there were mutations in thePAA1 gene of the mutant?paa1-2. There were four base deletions at 1512-1515 bp， which led to coding mutations and early termination of protein translation.?PAA1-2maight be a new allele of?PAA1gene.

Keywordsrice （Oryza sativaL.）;?panicle apical abortion mutant;paa1-2; phenotype;?gene

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.012

水稻作為全球約一半以上人口的主食，是發(fā)展中國家最重要的糧食作物^[1]。隨著全球人口增多，耕地面積減少，生態(tài)環(huán)境逐步惡化，提高水稻產(chǎn)量對于滿足糧食需求和保障糧食安全具有很大的意義^[2-5]。每穗粒數(shù)是決定水稻產(chǎn)量的重要因素之一，在每株穗數(shù)不變的基礎(chǔ)上，增加每穗粒數(shù)是提高水稻產(chǎn)量的重要途徑之一^[6-8]。然而，當(dāng)水稻穗處于小花發(fā)育階段時(shí)，已經(jīng)形成的小穗容易發(fā)生退化，造成穗子體積減小，穗粒數(shù)大幅度減少，此現(xiàn)象被稱為“開花前小花退化”（pre-flowering floret abortion）。穗部退化主要包括2種類型，分別是穗基部小穗退化和穗頂部小穗退化，而穗頂部退化現(xiàn)象在水稻育種過程中更為普遍。研究水稻穗頂部退化發(fā)生的分子機(jī)制，對水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、育種具有重要的理論與實(shí)踐意義。

水稻穗頂部退化是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，且易受到環(huán)境因素影響，因此加大了其研究難度。目前對穗頂部退化的研究已有一定的進(jìn)展，但是大多數(shù)研究集中在QTL位點(diǎn)檢測和突變體的精細(xì)定位^[9-13]。目前僅有2個(gè)穗頂部退化相關(guān)的基因被克隆。Bai等^[14]和Heng等^[15]利用突變體成功克隆了2個(gè)水稻穗頂部小穗退化相關(guān)基因，分別是TUTOU1和PAA1。突變體tutou1表現(xiàn)出一因多效的表型，除了穗頂部發(fā)生小穗退化外，還伴隨矮稈、短穗、花器官異常、根變短等特征。通過對不同組織的RT-PCR分析，結(jié)果表明該基因在根、莖、葉、小穗中均勻表達(dá)，并且表達(dá)水平在小穗中是最高的。TUTOU1基因編碼一個(gè)有功能的SCAR/WAVE同源蛋白，在水稻穗的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。突變體paa1是Heng等^[15]從kitaake組織培養(yǎng)后代中鑒定得到的一個(gè)穗頂部退化突變體。經(jīng)圖位克隆和測序發(fā)現(xiàn)，突變體paa1的LOC_Os02g45160基因在一個(gè)剪切位點(diǎn)上存在單堿基的突變，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生錯(cuò)誤。PAA1基因編碼一個(gè)鋁激活的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。突變體paa1中PAA1基因的突變導(dǎo)致頂部小穗細(xì)胞內(nèi)蘋果酸含量的降低，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡遭到破壞，從而有可能導(dǎo)致活性氧（ROS）爆發(fā)，引起頂部穗細(xì)胞發(fā)生死亡，導(dǎo)致突變體paa1頂部小穗的退化。本課題組在前期工作中利用⁶⁰Co-γ射線輻照處理一個(gè)來自尼日利亞的秈稻品種SIPI干種子，輻射劑量為300 Gy，隨后種植多代篩選，最終獲得一個(gè)穩(wěn)定遺傳的水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2。本研究對突變體paa1-2進(jìn)行表型特征觀察分析，同時(shí)根據(jù)已報(bào)道的水稻穗頂部小穗退化相關(guān)基因TUTOU1和PAA1的基因組序列設(shè)計(jì)引物，對野生型和突變體paa1-2進(jìn)行測序分析等位基因型，以期為控制水稻穗頂端小穗退化的分子機(jī)制研究提供參考。

1??材料與方法

1.1材料

利用⁶⁰Co-γ射線300 Gy輻照秈稻品種SIPI（尼日利亞）干種子，隨后多代種植篩選出穩(wěn)定遺傳的水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2。2018年春季在海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻綜合試驗(yàn)基地種植野生型和突變體paa1-2，行距設(shè)定20 cm，株距設(shè)定13.3 cm，單株插秧，與常規(guī)大田的水肥病蟲管理方法一致。

1.2方法

1.2.1 ?PCR擴(kuò)增??PCR總反應(yīng)體系為30 ?L，其中15.0 ?L Mix（2×Power Taq PCR MasterMix）、12.0 ?L ddH₂O、1.0 ?L forward primer（10 mmol/L）、1.0 ?L reverse primer（10 mmol/L）、1.0 ?L模板DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃?5 min;循環(huán)（95 ℃?30 s，58 ℃?30 s，72 ℃?1.5 min）35次;72 ℃?5 min，4 ℃保存。

1.2.2TUTOU1和PAA1基因的等位基因序列測定??在國家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.?cn/gene/index.htm）檢索TUTOU1和PAA1基因，基因符號分別為LOC_Os01g11040和LOC_Os02g45160，獲得已公布的基因序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增出野生型和突變體paa1-2中TUTOU1和PAA1等位基因的DNA片段，回收之后對DNA片段進(jìn)行測序、拼接和序列比對，基因測序由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司完成。測序結(jié)果用seqman軟件拼接，用DNAman 6.0軟件進(jìn)行比對分析。本研究用于擴(kuò)增突變體paa1-2中TUTOU1和PAA1基因的Indel標(biāo)記序列信息見表1。

2??結(jié)果與分析

2.1水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2的表型鑒定

水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2在營養(yǎng)生長時(shí)期表現(xiàn)正常，與野生型相比沒有明顯的差異。而到抽穗期時(shí)，突變體paa1-2穗的頂部小穗出現(xiàn)明顯的退化現(xiàn)象，表現(xiàn)為干癟和壞死狀態(tài)，而且突變體的穗一直保持著直立的形態(tài)，相反野生型的穗在開花后期就開始彎曲下垂（圖1A，圖1B）。

A：抽穗之后的整株表型;B：抽穗之后的穗部表型;C、D：野生型與paa1-2突變體幼穗發(fā)育6期和7期的表型;E、F：表示C、D中所對應(yīng)的頂部小穗表型。

A： gross morphology of the wild-type （left） and?paa1-2（right） plants after heading; B： panicle morphology of the wild-type （left） andpaa1-2 （right） after heading; C， D： phenotypic of the WT andpaa1-2at the 6th and 7th stage of early panicle differentiation， respectively; E， F： representative spikelets from the top of the corresponding panicles shown in C and D.

為了進(jìn)一步了解突變體paa1-2頂部小穗發(fā)生退化的具體階段，我們根據(jù)幼穗分化的8個(gè)發(fā)育時(shí)期對突變體paa1-2的頂部穎花進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體paa1-2在幼穗發(fā)育6期之前，與野生型相比無明顯差異，而在幼穗發(fā)育7期時(shí)，paa1-2頂部的小穗發(fā)育停滯，仍處于淺白色的狀態(tài)，而且paa1-2中部和基部的小穗生長狀態(tài)和野生型基本一致（圖1C，圖1D，圖1E，圖1F）。這些結(jié)果表明突變體paa1-2穗頂部退化表型是在幼穗發(fā)育6期后產(chǎn)生的。突變體paa1-2頂部退化的小穗在籽粒成熟之后幾乎都發(fā)生脫落，最終導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低。

2.2水稻穗頂部小穗退化相關(guān)基因TUTOU1和PAA1在突變體paa1-2中的基因序列分析

通過對TUTOU1和PAA1這2個(gè)基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，突變體paa1-2和野生型的TUTOU1基因序列一致，而突變體paa1-2的PAA1基因存在突變，測序發(fā)現(xiàn)其在第1512～1515 bp處存在4個(gè)堿基的缺失（圖2），即第3個(gè)外顯子上有4個(gè)堿基的缺失，從而引起基因移碼突變，從第424位谷氨酸之后的氨基酸發(fā)生改變，蛋白翻譯提前終止（圖3）。且突變體paa1-2與突變體paa1在表型上相似，因此，PAA1-2可能是已被報(bào)道的PAA1基因新的等位突變基因。

3??討論

水稻產(chǎn)量是一種復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，主要由每株穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重3個(gè)因素所決定^[16-17]。水稻育種研究者都一致追求大穗、多粒，這也是育種的主要目標(biāo)之一。然而水稻育種中普遍出現(xiàn)水稻穗頂部穎花退化現(xiàn)象，導(dǎo)致水稻單產(chǎn)嚴(yán)重下降，因此，開展關(guān)于水稻穗部退化相關(guān)的分子機(jī)制研究工作迫在眉睫。目前認(rèn)為水稻穗頂部小穗退化受環(huán)境和生理因素的影響，如外界的溫度、濕度、光照、土壤中的營養(yǎng)條件和不同水稻品種本身的遺傳背景等^[18]，是一個(gè)多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。近年來已有很多控制水稻穗頂部退化的QTL位點(diǎn)被報(bào)道，但由于QTL位點(diǎn)很難分離，所以通過QTL精細(xì)定位找到控制水稻穗頂部退化基因的難度很大，關(guān)于水稻穗頂部小穗退化的遺傳和分子機(jī)制還知之甚少^[9-13]。

突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料，在揭示水稻重要性狀的相關(guān)基因及其分子機(jī)制研究中具有重要的科學(xué)價(jià)值^[19-20]。因此通過篩選與鑒定水稻穗頂部小穗退化突變體，有利于加快開展水稻穗頂部小穗退化的分子調(diào)控機(jī)制研究。本文報(bào)道的突變體paa1-2的突變表型與突變體paa1表型相似，其在PAA1基因序列上比野生型少4個(gè)堿基，從而引起基因移碼突變并使得蛋白翻譯提前終止，說明PAA1-2很有可能是PAA1的復(fù)等位基因。田間表型觀察發(fā)現(xiàn)，突變體paa1-2在抽穗前與野生型比較，在外觀上無任何差異，抽穗后明顯表現(xiàn)出穗頂部退化，籽粒成熟之后，突變體頂部退化的小穗幾乎都發(fā)生脫落，最終造成株高、穗長、每穗粒數(shù)都顯著降低，與突變體paa1的表型一致。

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