急性白血病相關(guān)巨噬細(xì)胞的性質(zhì)及rhIFN-γ對(duì)其影響的研究*

宋建新，歐陽(yáng)紅梅，聞 艷,撒亞蓮

(云南省第一人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.血液科；3.臨床基礎(chǔ)研究所，昆明 650032)

巨噬細(xì)胞是一類具有遷移性、異質(zhì)性的免疫細(xì)胞；在不同微環(huán)境中，其可被招募并極化為具有不同分子特征和功能的亞群，即M1型或M2型，M1型與M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌白細(xì)胞介素(IL)-12和IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子，參與促腫瘤或抗腫瘤作用[1-3]。前期本課題組應(yīng)用巨噬細(xì)胞的泛標(biāo)志物CD68(M1型+M2型)、CD163(M2型)，研究了慢性粒細(xì)胞白血病(CML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)骨髓微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的變化發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞被大量募集進(jìn)入CML及MDS患者骨髓微環(huán)境，并逐漸向M2型極化，與疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系[4-6]。那么，在急性白血病(AL)患者骨髓微環(huán)境中，是否存在巨噬細(xì)胞的過(guò)度浸潤(rùn)，是以M1型為主或M2型為主或二者兼有，是否與AL的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)；重組人干擾素-γ(rhIFN-γ)對(duì)其在荷瘤情況下的干預(yù)是有利于溶癌，還是有利于腫瘤逃逸，這些都是有意義、值得明確的科學(xué)問(wèn)題，本課題組將對(duì)其進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2017年5月初診AL患者97例，其中男58例，女39例，男女比例為1.49∶1.00；年齡8個(gè)月至82歲，平均(40.90±14.54)歲。97例AL患者中，急性髓系白血病(AML組)71例，其中M0 5例，M1 8例，M2 5例，M3 12例，M4 23例，M5 18例，年齡7～82歲，平均(45.26±13.31)歲；急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL組)26例，其中B細(xì)胞型(B)-ALL 19例，T細(xì)胞型(T)-ALL 7例，年齡8個(gè)月至72歲，平均(43.62±16.18)歲。在97例AL患者中，追蹤觀察53例經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化療1～2個(gè)療程患者，共有37例達(dá)到形態(tài)學(xué)完全緩解(CR)，其中AML 24例、ALL 13例，年齡4～69歲，平均(44.59±11.82)歲；16例未緩解(NR)或部分緩解(PR)，其中AML 8例、ALL 8例，年齡11～76歲，平均(46.47±16.58)歲。追蹤觀察37例CR患者，有8例復(fù)發(fā)，其中AML 2例、ALL 6例，年齡14～69歲，平均(42.35±12.74)歲。診斷、緩解及復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)符合AL標(biāo)準(zhǔn)[7]。選取同期體檢的30例健康者為對(duì)照組，排除血液系統(tǒng)惡性疾病、免疫相關(guān)及感染相關(guān)疾病，其中男18例，女12例，男女比例為1.50∶1.00，年齡11～76歲，平均(47.50±10.24)歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得所有受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 鼠抗人CD68、CD163抗體，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；IL-10、TNF-α試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)天津昊陽(yáng)生物公司；rhIFN-γ購(gòu)自上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；FC500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；細(xì)胞培養(yǎng)24孔板購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD68、CD163 常規(guī)骨髓穿刺取骨髓組織，置于10%福爾馬林液固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、3～4 μm厚切片；采用SP免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CD68、CD163的表達(dá)。巨噬細(xì)胞體積較大，形態(tài)多樣，呈類圓形或不規(guī)則形，偶見(jiàn)多核細(xì)胞；CD68陽(yáng)性表達(dá)于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)含清晰的黃褐色至棕黃色顆粒狀者為陽(yáng)性細(xì)胞；CD163陽(yáng)性表達(dá)于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)清晰的黃褐色至棕黃色顆粒狀者為陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖1。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師各自獨(dú)立判斷，結(jié)果相同為最終檢驗(yàn)結(jié)果，若有異議，由上級(jí)醫(yī)師進(jìn)行最終判斷。首先在低倍鏡(×40)下選取5個(gè)染色較好的視野，后在高倍鏡(HP，×400)下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù),取其平均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3AL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)及rhIFN-γ的干預(yù)作用 取AML患者骨髓液2.0～3.0 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離獲取單個(gè)核細(xì)胞,9.0 g/L生理鹽水洗滌單個(gè)核細(xì)胞2次；用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度為1×105/mL，以每孔1.0 mL接種于24孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個(gè)平行孔，每孔分別加入終濃度為0、4×104、2×105、1×106U/L的rhIFN-γ，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，經(jīng)EDTA消化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD68+、CD163+細(xì)胞；收集培養(yǎng)上清液，用于IL-10、TNF-α檢測(cè)。

1.2.4CD68+、CD163+細(xì)胞檢測(cè) 于2支流式專用試管中加入細(xì)胞溶液100 μL，對(duì)照管中加入IgG1-藻紅蛋白(PE)、IgG1-異硫氰酸熒光素(FITC)抗體各20 μL；測(cè)定管加入CD68-PE、CD163-FITC抗體各20 μL，混勻后室溫下避光孵育30 min；用PBS洗滌，棄上清液，加入500 μL PBS混勻，上機(jī)測(cè)定。

1.2.5細(xì)胞因子檢測(cè) IL-10、TNF-α水平測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.13組治療前骨髓中CD68+、CD163+細(xì)胞的表達(dá)情況 AML組和ALL組患者CD68+和CD163+細(xì)胞的浸潤(rùn)密度均高于對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而AML組與ALL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 3組治療前CD68+、CD163+細(xì)胞水平比較個(gè)/HP)

a：P<0.05，對(duì)照組比較

圖1 不同狀態(tài)AL患者骨髓中CD68+、CD163+細(xì)胞的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×400)

表2 不同狀態(tài)AL患者骨髓中CD68+、CD163+細(xì)胞水平比較個(gè)/HP)

a：P<0.05，與AL患者比較；b：P<0.05，與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與CR患者比較

表3 CR與NR/PR患者治療前CD68+、CD163+細(xì)胞水平比較個(gè)/HP)

2.2不同狀態(tài)AL患者骨髓中CD68+、CD163+細(xì)胞表達(dá)情況 CR患者CD68+、CD163+水平低于AL患者，而高于對(duì)照組(P<0.05)；NR/PR患者與復(fù)發(fā)患者和初診AL患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

2.3CR患者與NR/PR患者CD68+、CD163+細(xì)胞表達(dá)情況 CR患者CD68+、CD163+水平低于NR/PR患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖1。

2.4不同濃度rhIFN-γ對(duì)AML骨髓單個(gè)核細(xì)胞干預(yù)后CD68+、CD163+變化情況 AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)不同濃度rhIFN-γ干預(yù)7 d后，CD68+水平隨著干預(yù)濃度的增高而逐漸升高，但在各干預(yù)濃度間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD163+水平隨著干預(yù)濃度的增高而逐漸降低，當(dāng)干預(yù)濃度大于或等于2×105U/L時(shí)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而當(dāng)干預(yù)濃度為1×106U/L時(shí)，CD163+與CD68+水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖2。

表4 不同濃度rhIFN-γ對(duì)AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞干預(yù)后CD68+、CD163+的變化情況

a：P<0.05,與0 U/L比較；b:P<0.05，與CD68+細(xì)胞比較

2.5不同濃度rhIFN-γ對(duì)AML骨髓單個(gè)核細(xì)胞干預(yù)后IL-10、TNF-α變化情況 IL-10水平隨著干預(yù)濃度的增高而降低，TNF-α水平則隨著干預(yù)濃度的增高而升高，當(dāng)干預(yù)濃度為1×106U/L時(shí)，IL-10和TNF-α水平與0 U/L分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

圖2流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度rhIFN-γ對(duì)AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞干預(yù)后CD68+、CD163+變化情況

表5 不同濃度rhIFN-γ對(duì)AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞干預(yù)后IL-10、TNF-α變化情況

a：P<0.05，與0 U/L比較

3 討論

AL是因造血干/祖細(xì)胞于分化過(guò)程中在較早階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，隨著對(duì)AL治療技術(shù)的不斷進(jìn)步，尤其是骨髓移植和造血干細(xì)胞移植的發(fā)展應(yīng)用，AL治愈率得到明顯提高，但對(duì)微小殘留的清除仍是棘手的問(wèn)題，這也是CR后復(fù)發(fā)的原因之一。有研究顯示，在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中存在M2型巨噬細(xì)胞的異常浸潤(rùn)，且與疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[8]，但在AL患者骨髓微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及極化表型還鮮見(jiàn)報(bào)道。

rhIFN-γ是由活化T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生分泌的細(xì)胞因子之一，有著“雙刃劍”作用，在腫瘤組織中有正向抗腫瘤作用，還有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的負(fù)向作用[9]，其除發(fā)揮直接作用外，還間接調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，rhIFN-γ可將M2型巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞，參與輔助性T細(xì)胞(Th)1型免疫應(yīng)答[11]。

通過(guò)對(duì)AL患者骨髓巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，在初診AL患者中，無(wú)論AML還是ALL患者骨髓中均有CD68+、CD163+巨噬細(xì)胞的異常浸潤(rùn)，且浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞以M2型(即CD163+)為主，提示AL患者骨髓微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞可能通過(guò)自分泌和(或)旁分泌途徑參與白血病細(xì)胞的惡性增殖、抵抗凋亡及侵襲[12-13]，導(dǎo)致AL的發(fā)生、發(fā)展。追蹤觀察53例初治AL患者的CD68+、CD163+還發(fā)現(xiàn)，治療1～2個(gè)療程達(dá)CR的患者，CD163+的浸潤(rùn)密度明顯低于NR/PR患者，提示骨髓中M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與AL患者的療效、預(yù)后有直接關(guān)系，即治療前M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度高的患者對(duì)治療反應(yīng)差。在追蹤C(jī)R后又復(fù)發(fā)8例患者，M2型巨噬細(xì)胞與初診患者骨髓中M2型巨噬細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示M2型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)白血病干細(xì)胞(LSCs)的生存、遺傳的不穩(wěn)定性及克隆演變，這可能為探討針對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向治療AL，清除白血病微小殘留提供理論依據(jù)。

本研究還顯示，CR患者骨髓組織中的M2型巨噬細(xì)胞有所降低，但仍明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明AL患者骨髓雖然達(dá)到形態(tài)學(xué)和(或)基因水平上的暫時(shí)緩解，但促進(jìn)LSCs生存、分化、增殖的因素還未完全消除，這也可能是AL最終復(fù)發(fā)的原因之一。

對(duì)rhIFN-γ干預(yù)的研究結(jié)果顯示，CD68+占所有單個(gè)核細(xì)胞的百分率隨著干預(yù)濃度的增加略有升高，CD163+略低于CD68+，但與rhIFN-γ為0 U/L比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在初診AL患者骨髓中，主要是M2型巨噬細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)；而隨著干預(yù)濃度的逐漸增高，M2型巨噬細(xì)胞也逐漸降低，說(shuō)明在rhIFN-γ干預(yù)后，已有部分M2型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化，提示rhIFN-γ在AL荷瘤情況下具有將M2型巨噬細(xì)胞向M1型“逆轉(zhuǎn)”的作用，這也間接證實(shí)了IL-10隨著rhIFN-γ干預(yù)濃度的增加應(yīng)逐漸降低，而TNF-α隨著干預(yù)濃度的增加應(yīng)逐漸增高。

綜上所述，AL患者骨髓微環(huán)境中巨噬細(xì)胞被大量招募并被極化為M2型巨噬細(xì)胞，使骨髓微環(huán)境發(fā)生變化，可能與AL的發(fā)生、療效、預(yù)后相關(guān)。在AL荷瘤情況下，一定濃度的rhIFN-γ具有將M2型向M1型巨噬細(xì)胞“逆轉(zhuǎn)”的功能。