莫沙必利聯(lián)合米曲菌胰酶片對功能性消化不良模型小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響及其機(jī)制的研究*

李偉冬,江舒曼,賈 林

(廣東省廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 510180)

Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)將功能性消化不良(FD)定義為起源于胃十二指腸的癥狀[1]，其病因復(fù)雜，病程遷延，復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。國內(nèi)FD的發(fā)病率約20%，其門診量占消化?？频?0%～70%[2]。國內(nèi)外已有不少研究報(bào)道莫沙必利聯(lián)合米曲菌胰酶片治療FD，能夠影響患者胃腸激素的表達(dá)水平，改善患者胃動(dòng)力障礙，但關(guān)于其內(nèi)在機(jī)制的研究報(bào)道極少。有報(bào)道認(rèn)為核因子-κB(NF-κB)的激活可以促進(jìn)影響胃腸道損傷的炎性因子的表達(dá)水平上調(diào)，在FD的發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵性的作用[3]。本研究設(shè)想莫沙必利聯(lián)合米曲菌胰酶片可通過影響NF-κB的表達(dá)，調(diào)控一系列促炎細(xì)胞因子及胃腸激素的表達(dá)水平，從而達(dá)到治療FD的效果。本研究構(gòu)建了Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)FD模型[4]，并檢測了莫沙必利和米曲菌胰酶片單用及聯(lián)用治療前后細(xì)胞胃腸激素及NF-κB等促炎因子的表達(dá)變化，初步探索其作用機(jī)制，希望能為進(jìn)一步的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)并為FD治療提供新的治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c小鼠及SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2016-004。培養(yǎng)在溫度為22 ℃、濕度為60%～70%的環(huán)境中，每天12 h光照/黑暗交替，自由攝食。

1.2方法

1.2.1原代小鼠小腸ICC培養(yǎng)、鑒定及分組 選用Balb/c小鼠5只，雌雄不限，禁食24 h后處死；取出小腸，于顯微鏡下剝離小腸黏膜層后，將小腸組織剪成碎片；將Ⅱ型膠原酶(批號1202775，美國Gibco公司)加入盛有小腸碎片組織的燒杯中，于37 ℃消化30 min,離心，用Hank′s液(批號12350039，美國Gibco公司)重懸沉淀，過200目篩除去大塊組織；用M199培養(yǎng)基(批號1302027，美國Gibco公司)培養(yǎng)細(xì)胞，放入5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，隔天換液，繼續(xù)培養(yǎng)。將ICC放置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；通過免疫熒光的方法檢測原代培養(yǎng)ICCc-kit的表達(dá)來鑒定ICC[4-5]。

1.2.2FD大鼠模型及細(xì)胞模型的構(gòu)建 40只SD大鼠分成正常動(dòng)物組，10只，造模后予生理鹽水2 mL灌胃，3次/天；FD動(dòng)物模型組，10只，造模后予生理鹽水2 mL灌胃，3次/天；莫沙必利動(dòng)物組，10只，造模后予莫沙必利(瑞琪，江蘇豪森藥業(yè))灌胃，每天劑量0.27 mg/kg，3次/天；米曲菌胰酶片動(dòng)物組，10只，1片米曲菌胰酶片(慷彼申，德國NORDMARK ARZNEIMITTEL GmbH & Co.KG公司)溶于6 mL溫開水，造模后分3次使用，時(shí)間同Ⅲ組；聯(lián)合治療動(dòng)物組，10只，造模后予莫沙必利及米曲菌胰酶灌胃，劑量與次數(shù)同Ⅲ、Ⅳ組。除正常組外，其余4組大鼠都采用夾尾刺激引發(fā)大鼠打斗法進(jìn)行FD造模，造模7 d后開始給藥，連續(xù)10 d灌胃后處死并制備相應(yīng)血清。

用含有5%胎牛血清的全成分細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)ICC24 h，使其同步化。將制備好的對應(yīng)正常細(xì)胞組(A組)、FD細(xì)胞模型組(B組)、莫沙必利組(C組)、米曲菌胰酶片組(D組)及聯(lián)合治療組(E組)血清，按組別加入ICC培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3檢測方法 按說明書利用ELISA方法(武漢華美生物)檢測各組ICC上清液中胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(GAS)、P物質(zhì)(SP)、5-羥色胺(5-HT)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的水平。利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)觀察NF-κB在各組細(xì)胞中的表達(dá)分布。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測各組處理后的ICC上清中NF-κB激酶抑制因子(IKK)、NF-κB和NF-κB抑制因子(IκB)基因mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1原代ICC形態(tài)及免疫熒光鑒定結(jié)果 熒光顯微鏡下見大多數(shù)原代ICC的胞體呈現(xiàn)紡錘形或星形，細(xì)胞核多為圓形且體積較大，約占所有細(xì)胞的2/3，胞體邊緣較為清晰，有3～5個(gè)明顯的突起且突起相互間存在聯(lián)系，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長，ICC形態(tài)特征更加突出。原代培養(yǎng)ICC在熒光顯微鏡下可見明顯的c-kit陽性信號，見圖1。

2.2FD細(xì)胞模型 A組ICC整體呈紡錘形，細(xì)胞邊緣突起較多，且突起間相互連接成網(wǎng)，細(xì)胞核較大，細(xì)胞邊緣清晰可見；B組FD模型ICC整體趨向扁平化，細(xì)胞突起較少，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞間縫隙明顯縮小，見圖2。

圖1 熒光顯微鏡下原代ICC形態(tài)(免疫熒光染色，×400)

2.35組胃腸激素及炎性因子表達(dá)水平比較 與A組比較，B組MTL、SP、5-HT的表達(dá)水平明顯降低，GAS、NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與B組比較，C組MTL和5-HT表達(dá)水平明顯上升，GAS、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平有所下降(P<0.05)。D組SP和5-HT表達(dá)水平較B組明顯升高且NO、IL-6和TNF-α表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與C、D組比較，E組MTL、SP、5-HT的表達(dá)水平均明顯升高，GAS、NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.45組NF-κB(p65)表達(dá)分布情況 免疫熒光結(jié)果顯示：與A組比較，B組NF-κB的表達(dá)明顯上升；而與B組比較，C、D、E組NF-κB的表達(dá)均有所降低，其中E組降低最為明顯(P<0.05)，見圖3。

A:A組;B:B組

圖2熒光顯微鏡下ICC形態(tài)(免疫熒光染色，×400)

表1 各組胃腸道激素和炎性因子的表達(dá)

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較;d：P<0.05，與D組比較

A～E:A～E組

圖3 5組NF-κB(p65)表達(dá)分布情況(免疫熒光染色，×400)

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較;d：P<0.05，與D組比較

圖4 5組IKK、IκB、NF-κB(p65)mRNA表達(dá)

2.55組IKK、IκB、NF-κB(p65)mRNA表達(dá)水平比較 與A組比較，B組血清中的IκB mRNA的表達(dá)水平較低，而IKK、NF-κB mRNA的表達(dá)水平較高(P<0.05)。與B組比較，C、D組IκB mRNA表達(dá)水平較高，而IKK、NF-κB mRNA的表達(dá)水平較低(P<0.05)；E組IκB mRNA的表達(dá)水平較高，而IKK、NF-κB mRNA的表達(dá)水平較低，且較C、D組差異更為明顯(P<0.05)，見圖4。

3 討論

FD的發(fā)病因素眾多，包括上消化道運(yùn)動(dòng)障礙、內(nèi)臟高敏感性、胃酸分泌過多、幽門螺旋桿菌感染、社會(huì)、心理、飲食等諸多因素，其中胃腸道動(dòng)力障礙和內(nèi)臟高敏感性被認(rèn)為是其主要病理基礎(chǔ)[6]，也有多項(xiàng)研究及羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)幽門螺旋桿菌感染因素的重要性[1，7-8]。

胃腸激素是參與消化道機(jī)械運(yùn)動(dòng)、消化液分泌等生理活動(dòng)的肽類激素，主要包括MTL、GAS、CGRP、Ghrelin等，其與相對應(yīng)受體結(jié)合后可通過調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放參與到胃腸機(jī)械運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用中，其表達(dá)水平與FD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9-11]。研究證實(shí)NF-κB信號途徑可能參與胃腸激素的合成與分泌，其激活可以上調(diào)胃腸道損傷的炎性因子水平，在FD的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[2,12-14]。莫沙必利及米曲菌胰酶片在臨床上已被廣泛用于治療包括FD在內(nèi)的一系列功能性胃腸病[15-17]。國內(nèi)外已有不少文獻(xiàn)報(bào)道莫沙必利聯(lián)合米曲菌胰酶片治療FD，能夠影響患者胃腸激素的表達(dá)水平，有效改善患者胃動(dòng)力障礙，從而緩解FD癥狀。本研究檢測了FD細(xì)胞模型中部分胃腸激素(MTL、GAS)及神經(jīng)遞質(zhì)(SP、5-HT)的表達(dá)情況，并研究了莫沙必利、米曲菌胰酶片單獨(dú)治療及聯(lián)合治療前后MTL、GAS、SP、5-HT的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，經(jīng)莫沙必利或米曲菌胰酶片單獨(dú)處理后，MTL、SP、5-HT的表達(dá)水平均得到一定程度的恢復(fù)，而在莫沙必利和米曲菌胰酶片兩者聯(lián)合處理之后MTL、SP、5-HT得到更大程度的恢復(fù)。表明兩者聯(lián)合處理的治療效果強(qiáng)于各自單獨(dú)治療，可以起到協(xié)同作用，且兩者很可能通過改善胃腸激素的表達(dá)來發(fā)揮其治療作用。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活可以促進(jìn)影響胃腸道損傷的炎性因子表達(dá)水平上調(diào)，被認(rèn)為在FD的發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵性的作用。因此，本研究猜測莫沙必利聯(lián)合米曲菌胰酶片是否是通過影響NF-κB的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控一系列促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，改善胃腸激素的失衡，從而達(dá)到治療FD的效果。本研究在ICC上建立了FD細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路被激活，經(jīng)莫沙必利或米曲菌胰酶片單獨(dú)處理后，NF-κB信號通路得到一定程度的抑制，而在莫沙必利和米曲菌胰酶片聯(lián)合處理之后，NF-κB信號通路被抑制的程度更大。由此可以推測莫沙必利聯(lián)合米曲菌胰酶片治療FD的分子機(jī)制，可能是通過抑制NF-κB信號通路，下調(diào)炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，從而恢復(fù)相關(guān)胃腸道激素和神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)水平。

綜上所述，莫沙必利和米曲菌胰酶片聯(lián)合治療對FD模型大鼠中失調(diào)的胃腸激素及炎性因子具有明顯調(diào)節(jié)作用，聯(lián)用效果較單藥治療更為明顯。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平對莫沙必利聯(lián)合米曲菌胰酶片治療FD的機(jī)制進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果與眾多臨床試驗(yàn)相印證；從NF-κB信號通路與胃腸激素合成釋放的關(guān)系切入，充分探討了聯(lián)合治療的作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床研究提供條件。