棉酚降解酶對(duì)棉籽粕酶解脫毒的條件參數(shù)優(yōu)化

楊文婷，陳 程，張文舉

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，飼料資源特別是蛋白類飼料缺乏的問題尤為嚴(yán)峻。棉籽粕中粗蛋白的含量一般為40%左右，有的甚至高達(dá)50%左右，僅次于豆粕，而高于菜籽粕[1]。我國(guó)每年產(chǎn)1 000×104t以上的棉籽，棉籽餅粕年產(chǎn)量在600×104t以上，資源量排全球第一[2]。我國(guó)棉籽粕蛋白飼料資源豐富，但由于其中有毒物質(zhì)游離棉酚(Free gossypol,FG)會(huì)對(duì)單胃動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等方面產(chǎn)生明顯的不良影響[3-4]，限制了其作為安全而有效的植物性蛋白飼料，造成飼料資源的嚴(yán)重浪費(fèi)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉籽粕固態(tài)微生物發(fā)酵是目前認(rèn)為最安全有效的脫毒方法。其發(fā)酵的整個(gè)過程條件較溫和，對(duì)棉籽粕中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞較小[5]，但是發(fā)酵慢，耗時(shí)較多，并且大多棉籽粕發(fā)酵采用熟料(經(jīng)高壓滅菌)通過單菌或混合菌進(jìn)行發(fā)酵[6-11]，能源消耗較大[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，從酶學(xué)角度進(jìn)行棉酚酶解脫毒方法的研究未見報(bào)道。研究棉酚降解酶的脫毒效果及優(yōu)化條件參數(shù)，是棉酚酶解脫毒的重要內(nèi)容?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究用異源表達(dá)獲得的棉鈴蟲棉酚降解酶對(duì)棉籽粕進(jìn)行固態(tài)生料酶解脫毒，分析酶解脫毒效果，優(yōu)化酶解脫毒參數(shù)，為棉籽粕固態(tài)生料酶解脫毒提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

棉籽粕，新疆石河子產(chǎn)，粉碎，過40目篩，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。該棉籽粕的FG含量為341.02 mg/kg。

棉酚降解酶，由實(shí)驗(yàn)室通過重組棉鈴蟲CPR、CYP6AE12基因，畢赤酵母異源共表達(dá)棉鈴蟲細(xì)胞色素酶，獲取具有棉酚降解活性的酶蛋白CPR-CYP6AE12，經(jīng)驗(yàn)證該酶蛋白作用于棉酚時(shí)，棉酚含量會(huì)顯著性下降，同時(shí)棉酚中間代謝物會(huì)加速降解，因此,將該酶蛋白命名為棉酚降解酶[13]。

1.2 方 法

1.2.1 棉粕酶解條件參數(shù)優(yōu)化

將粉碎后未經(jīng)處理的棉籽粕50 g投入反應(yīng)器中，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、添加量、底物水分為優(yōu)化的4個(gè)因素。表1

表1 試驗(yàn)各因素和各水平
Table 1 Test factors and levels

水平因素溫度 (℃)時(shí)間(h)添加量(%)底物水分(%)1251.51352302.03403352.55454403.0750

試驗(yàn)按照L16(45)設(shè)置4因子4水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，試驗(yàn)共16個(gè)處理，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。酶解結(jié)束后，將酶解后的棉籽粕在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干48 h，溫度為60℃，粉碎，過60目篩，備用。以酶解后FG的含量為指標(biāo)確定最優(yōu)的酶解條件組合。表2

表2 棉酚降解酶固態(tài)生料發(fā)酵正交試驗(yàn)
Table 2 Orthogonal test results and analysis of solid raw meal fermentation of gossypol degradation enzyme

試驗(yàn)組別因素結(jié)果A(℃)B(h)C(%)D(%)FG含量(mg/kg)11(25)1(1.5)1(1)1(35)49.2421(25)2(2.0)2(3)2(40)55.5931(25)3(2.5)3(5)3(45)49.6041(25)4(3.0)4(7)4(50)50.8152(30)1(1.5)2(3)3(45)53.4262(30)2(2.0)1(1)4(50)58.0372(30)3(2.5)4(7)1(35)47.3882(30)4(3.0)3(5)2(40)45.8793(35)1(1.5)3(5)4(50)49.79103(35)2(2.0)4(7)3(45)41.61113(35)3(2.5)1(1)2(40)44.86123(35)4(3.0)2(3)1(35)46.91134(40)1(1.5)4(7)2(40)62.07144(40)2(2.0)3(5)1(35)51.87154(40)3(2.5)2(3)4(50)56.39164(40)4(3.0)1(1)3(45)64.79K151.31bAB53.71a54.23a48.85bK251.17bAB51.77a53.07ab53.08abK345.79cB49.55a49.28b51.35abK458.78aA52.09a50.64ab53.75aR12.994.164.954.90

注:K1-K4為各因素每一水平的平均值;R為最大與最小水平間極差值。K值同列肩標(biāo)字母相同者差異不顯著(P>0.05)，同列肩標(biāo)小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，同列肩標(biāo)大寫字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)

1.2.2 酶解最佳條件參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)正交試驗(yàn)后，以篩選出的最佳酶解參數(shù)條件進(jìn)行棉籽粕酶解，測(cè)FG。以此驗(yàn)證棉酚降解酶優(yōu)化后的條件參數(shù)效果。

1.2.3 FG測(cè)定

采用HPLC高效液相色譜法測(cè)定FG的含量，精確稱取棉籽粕或處理過的棉籽粕0.5 g，加入5 mL 70%丙酮室溫超聲波萃取30 min，每隔10 min上下翻動(dòng)一次，混合均勻。靜置后收集上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，以備上機(jī)檢測(cè)，具體試驗(yàn)條件參考文獻(xiàn)[13 ]。

脫毒率/%=(原料中FG含量-發(fā)酵后樣品中FG的含量)/原料中FG的含量×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)測(cè)得的原始數(shù)據(jù)先采用Excel軟件進(jìn)行初步整理，后用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析及LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉粕酶解條件參數(shù)優(yōu)化

研究表明，生料棉籽粕酶解后游離棉酚的含量經(jīng)分析，四個(gè)因素影響棉籽粕中游離棉酚的主次順序?yàn)锳>C>D>B,即酶解溫度>添加量>底物水分>酶解時(shí)間。通過對(duì)A(溫度)因素的各水平方差分析，K3與K4水平間差異極顯著(P<0.01)，K3與K1、K2水平間差異顯著(P<0.05)，因此,選擇35℃作為優(yōu)化結(jié)果。通過對(duì)B(時(shí)間)因素的各水平方差分析，K1、K2、K3、K4水平間差異不顯著(P>0.05)，1.5、2、2.5和3 h均可，從生產(chǎn)實(shí)際考慮，因此,選擇1.5 h作為優(yōu)化結(jié)果。通過對(duì)C(添加量)因素的各水平方差分析，可以看出K3與K1水平間差異顯著(P<0.05)，K3與K2、K4水平間差異不顯著(P>0.05)，表明3%、5%、7%的添加量均可，從生產(chǎn)實(shí)際考慮，因此,選擇3%作為優(yōu)化結(jié)果。通過對(duì)D(底物水分)因素的各水平方差分析，可以看出K1與K4水平間差異顯著(P<0.05)，K1與K2、K3差異不顯著(P>0.05)，35%、40%、45%的底物水分均可，選擇35%作為優(yōu)化結(jié)果。棉籽粕酶解最優(yōu)條件參數(shù)為A3B1C2D1，即溫度35℃、時(shí)間1.5 h、添加量3%、底物水分35%。表2

2.2 酶解最佳條件參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳酶解條件參數(shù)下，即酶解溫度35℃、酶解時(shí)間1.5 h、酶添加量3%、底物水分35%，酶解棉籽粕后，其中的游離棉酚含量從341.02 mg/kg降低至37.01 mg/kg，棉籽粕的脫毒率達(dá)到89.15%,與原棉籽粕相比FG含量極顯著(P<0.01)降低。

3 討 論

3.1 酶解溫度對(duì)棉酚降解酶酶解棉籽粕脫毒的影響

溫度是影響酶活的重要條件，酶活的高低與酶解效果有著直接的關(guān)系。酶解溫度在25～40℃時(shí)，棉籽粕中FG的含量較原棉籽粕顯著降低，且在35℃時(shí)，F(xiàn)G含量最低。但當(dāng)溫度為40℃時(shí)，F(xiàn)G的含量較35℃時(shí)顯著升高，有可能是因?yàn)?5℃時(shí)，已達(dá)到棉酚降解酶活性的最適溫度。當(dāng)溫度再升高時(shí)，其活性降低，甚至?xí)?dǎo)致酶失活以及變性[14]。

3.2 添加量對(duì)棉酚降解酶酶解棉籽粕脫毒的影響

經(jīng)分析棉酚降解酶添加量為1%、3%、5%、7%時(shí)，與原棉籽粕相比酶解后的棉籽粕中FG的含量顯著降低，說明棉酚降解酶對(duì)降解FG的效果顯著,這與陳程[13]的研究分析一致。添加量這一因素經(jīng)方差分析，K3與K1水平間差異顯著(P<0.05)，K3與K2、K4水平間差異不顯著(P>0.05)，可能是添加量在3%時(shí)棉酚降解酶的濃度已經(jīng)接近底物反應(yīng)的最大活性。

3.3 底物水分對(duì)棉酚降解酶酶解棉籽粕脫毒的影響

合適的底物水分能夠有效增大棉酚降解酶與棉籽粕中FG的接觸面積，從而極大發(fā)揮棉酚降解酶的作用，使FG的含量降低。底物中較低的含水量則不利于酶解，而較高的底物水分又會(huì)造成后期烘干時(shí)間長(zhǎng)而使生產(chǎn)成本提高。研究表明，底物水分在35%時(shí)棉籽粕中FG的含量最低且含水量既不低也不高，既有利于棉酚降解酶酶解棉籽粕，又不浪費(fèi)資源。

3.4 酶解時(shí)間對(duì)棉酚降解酶酶解棉籽粕脫毒的影響

由于棉籽粕中的FG存在于棉籽腺體中，需要一定的時(shí)間棉酚降解酶與棉籽腺體中的棉酚才能充分接觸，進(jìn)而才會(huì)完全發(fā)揮其降解作用。但時(shí)間過長(zhǎng)FG的含量又會(huì)上升，有可能是因?yàn)樵诿附膺^程中結(jié)合棉酚解離釋放出FG[15]。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)底物采用生料棉籽粕，無需進(jìn)行高溫高壓滅菌，因此,節(jié)約了生產(chǎn)成本。經(jīng)過比較酶解前后棉籽粕中游離棉酚的含量，可知由實(shí)驗(yàn)室異源共表達(dá)的棉鈴蟲棉酚降解酶對(duì)棉籽粕進(jìn)行酶解能夠有效的降解游離棉酚。結(jié)果表明：棉酚降解酶酶解棉籽粕的最佳生產(chǎn)條件為溫度35℃、時(shí)間1.5 h、添加量3%、底物水分35%。在此條件下棉籽粕的脫毒率達(dá)到89.15%。