花生幼苗期呼吸酶活性對漬澇的響應(yīng)

劉振宏，蔣 薇，劉登望*，李 林*，張 昊

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)旱地作物研究所，湖南 長沙 410128)

水是作物生長發(fā)育的重要生理生態(tài)因子，對作物的區(qū)域分布和生產(chǎn)水平存在巨大影響。在降雨量較大，排水設(shè)施較差或水位波動(dòng)劇烈的地區(qū)經(jīng)常發(fā)生漬澇危害。漬澇是世界作物生產(chǎn)的主要非生物逆境脅迫之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球10%的灌溉土地受到洪澇災(zāi)害的影響，這可能會(huì)降低高達(dá)20%的農(nóng)作物產(chǎn)量[1]。近50年來，我國多年平均洪澇災(zāi)害受災(zāi)面積約占全國播種總面積的6.4%，約為920萬hm2[2]，其中長江中下游地區(qū)和黃淮海平原受漬澇災(zāi)害的影響面積最大，約占全國總受災(zāi)面積75%以上[3]。隨著全球氣候變化異常加劇，漬澇等災(zāi)害更加頻繁，近年我國的洪澇災(zāi)害也有面積增大、危害加重趨勢。

漬澇害發(fā)生后，土壤水分過多，氧氣含量驟然減少，首先造成植株根際缺氧，根系的呼吸作用、營養(yǎng)物質(zhì)吸收嚴(yán)重受阻，繼而引起地上部分損傷甚至死亡[4]，包括光合作用減弱[5]，抑制植株生長分化、莢果發(fā)育[6-8]，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)[9-10]。然而，對于漬澇下花生根系的呼吸生理研究尚未見報(bào)道。本研究擬采用耐漬澇能力不同的品種，在不同時(shí)間和深度的漬澇脅迫程度下，測定幾種關(guān)鍵性呼吸酶活性，旨在探明不同耐性品種的呼吸途徑差異。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用土壤取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗(yàn)基地大田沙土。本試驗(yàn)選取3個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證在大田條件下具有耐澇性差異的花生栽培品種(Arachishypogaea)，分別為豫花15(耐澇)、中花8號(較耐澇)、中花4號(不耐澇)為供試品種[10-11]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 苗期試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

將沙土洗凈后，用10%過氧化氫消毒。選取各品種大小均勻、籽仁飽滿的優(yōu)良種子，分別在3個(gè)大塑料盆中濕潤培養(yǎng)。待種子芽長約等于種子長度時(shí)，按品種將種芽植入容量為700 mL的塑料盆中央，芽尖朝下，籽仁頂部埋深3 cm，每盆植入5株，呈均勻環(huán)狀分布，進(jìn)行正常水分培養(yǎng)，待植株長出四葉一心時(shí)開始以下處理。

1.2.2 淹水深度試驗(yàn)

參照大田發(fā)生漬澇害時(shí)的水體深度情形，對幼苗設(shè)置3種不同深度的漬澇處理：A組為全株淹沒(簡稱全淹，水體將幼苗植株完全淹沒3 cm以上)；B組為根部淹沒(簡稱半淹，水體高于幼苗根部土壤層約1 cm)；C組為正常水分(對照)。

1.2.3 淹水時(shí)長試驗(yàn)

將上述試驗(yàn)的A、B組材料，各分為6個(gè)淹水時(shí)長梯度處理，分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h。C組仍作為正常水分對照。試驗(yàn)期間，培養(yǎng)室溫度為晝25 ℃/夜20 ℃，每天光照14 h，照度240μmol·m-2·s-1。

1.3 樣本采集與測定方法

選取完整根系，自來水沖洗后，蒸餾水洗凈，濾紙吸干水分，用于測定。

1.3.1 琥珀酸脫氫酶SDH活性的測定

采用SDH試劑盒測定，由南京建成生物工程研究所提供。

酶比活性(U/mg prot)=[(ΔOD值/0.01)/反應(yīng)時(shí)間min]/樣品中蛋白毫克數(shù)

1.3.2 乳酸脫氫酶LDH活性的測定

采用LDH試劑盒測定，由南京建成生物工程研究所提供。

酶活性(U/L)=[OD(U)-OD(C)]/[OD(S)-OD(B)]×CS×N×1000，CS=2 mmol/L，N=1。

1.3.3 乙醇脫氫酶ADH活性的測定

采用紫外分光光度計(jì)法(湯章城)[12]。

酶活性(U/mg)=(ΔOD值/0.01)/反應(yīng)時(shí)間min。

2 結(jié) 果

2.1 有氧呼吸途徑酶活性差異

琥珀酸脫氫酶(SDH)是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶。從圖1可知，在半淹處理下，3個(gè)品種幼苗根系SDH活性隨處理時(shí)間延長有起伏變化。其中，豫花15號SDH活性變化最大，在96 h有最大峰值，較正常水分處理高出6.38倍；中花8號SDH活性變化曲線較豫花15號平緩，其峰值分別出現(xiàn)在48 h和120 h，120 h出現(xiàn)最大峰值，較正常水分高出252.00%；中花4號SDH活性最低，96 h

圖1 不同品種苗期半淹、全淹SDH活性變化情況Fig. 1 The changes of SDH activity of different peanut varieties in seedling stage under half and whole waterlogging condition

有最大活性，較正常水分處理高34.60%。中花4號SDH最大活性值活性較中花8號、豫花15號分別低29.78%和88.78%。全淹處理下，SDH活性變化曲線呈不規(guī)則的W型。3個(gè)品種SDH活性在24 h、72 h和168 h均為低谷，其中豫花15號48 h和120 h為峰值，120 h出現(xiàn)最大峰值，較正常水分高36.56%；中花4號、中花8號48 h和96 h為峰值，96h出現(xiàn)最大峰值，分別較正常水分高30.29%和143.00%。3個(gè)品種SDH活性峰值以豫花15號最高，較中花8號、中花4號分別高54.82%、70.39%。3個(gè)品種SDH活性均以半淹高于全淹，豫花15號半淹較全淹最大峰值高440.18%，中花8號和中花4號分別高33.67%和3.30%。

2.2 厭氧呼吸途徑酶活性差異

2.2.1 乳酸脫氫酶(LDH)活性

乳酸脫氫酶是底物不完全氧化時(shí)的關(guān)鍵呼吸酶。圖2得出，在半淹情況下，3個(gè)品種LDH活性均出現(xiàn)不同程度升高和回落。其中，中花4號變幅最大，中花8號次之，二者均在72 h出現(xiàn)最大峰值，較正常水分分別高117.00倍和46.70倍，豫花15號活性變化最小，且峰值較其他2個(gè)品種滯后24 h，在96 h處達(dá)到峰值，高出正常水分8.47倍。在全淹情況下，3個(gè)品種LDH活性也均出現(xiàn)不同程度升高和回落。其中，中花4號變幅最大，中花8號次之，二者均在72 h出現(xiàn)最大峰值，分別較正常水分處理高196.00倍和46.98倍；豫花15號活性變化最小，且峰值較其他2個(gè)品種要滯后24 h，在96 h達(dá)到峰值，較正常水分高38.02倍。中花4號LDH活性最大峰值較中花8號分別高出7.05倍、9.35倍。3個(gè)品種LDH活性最大峰值較正常水分處理漲幅均以全淹高于半淹，中花4號、中花8號、豫花15號分別高66.64%、0.58%和312.00%。

圖2 不同品種苗期半淹、全淹LDH活性變化情況Fig. 2 The changes of LDH activity of different peanut varieties in seedling stage under half and whole waterlogging condition

圖3 不同品種苗期半淹、全淹ADH活性變化情況Fig. 3 The changes of ADH activity of different peanut varieties in seedling stage under half and whole waterlogging condition

2.2.2 乙醇脫氫酶(ADH)活性

乙醇脫氫酶也是厭氧呼吸關(guān)鍵酶。從圖3可知，在半淹情況下，3個(gè)品種ADH活性均出現(xiàn)不同程度升高和回落。各品種均在72 h出現(xiàn)最大峰值，中花4號、中花8號、豫花15號活性較正常水分分別高4.60倍、4.00倍、3.33倍，中花4號比中花8號、豫花15號分別高出40.00%、115.00%。在全淹情況下，3個(gè)品種ADH活性也出現(xiàn)不同程度升高和回落。各品種最大峰值均出現(xiàn)在72 h，中花4號、中花8號、豫花15號較正常水分分別高11.60倍、7.75倍、3.00倍，中花4號較中花8號、豫花15號分別高出80.00%、425.00%。3個(gè)品種ADH活性最大峰值較正常水分漲幅均以全淹高于半淹，其中中花4號、中花8號分別高125.00%、75.00%，豫花15號反而低7.69%。

3 討 論

呼吸是生命活動(dòng)的最基本過程。植物的呼吸作用分為有氧呼吸和無氧呼吸。正常情況下，植物多進(jìn)行有氧呼吸，該途徑中植物體內(nèi)的葡萄糖生成丙酮酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TAC)被完全氧化生成CO2和水，并釋放大量能量，琥珀酸脫氫酶(SDH)是三羧酸循環(huán)的限速酶；而當(dāng)植物處于外界氧氣供應(yīng)不足的逆境情況下，為了短期內(nèi)維持植物體的機(jī)能，植物將會(huì)進(jìn)行無氧呼吸，此時(shí)葡萄糖生成的丙酮酸在三羧酸循環(huán)中不完全氧化，而產(chǎn)生乳酸和乙醇，并低效、少量釋放能量。丙酮酸位于無氧和有氧分解的交界點(diǎn)上，在無氧情況下，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化作用下，被途徑中生成的NADH還原為乳酸；或者在丙酮酸脫羧酶作用下脫羧生成乙醛，再在乙醇脫氫酶的作用下，將乙醛轉(zhuǎn)變成乙醇。若長期進(jìn)行無氧呼吸，將使得乳酸和乙醇在植株體內(nèi)大量積累，最終造成植株中毒死亡。

本試驗(yàn)條件下，花生苗期濕澇脅迫與正常水分比較，根系SDH活性降低，但LDH、ADH活性升高。同一品種在相同淹澇時(shí)間下，其SDH活性全淹低于半淹，而LDH、ADH相反。這一結(jié)果與李林等[13]、劉登望等[14]、Subbaiah等[15]、Andrewa等[16]結(jié)論一致，且ADH活性高低與品種耐澇性呈負(fù)相關(guān)。在淹澇初期花生根系SDH活性較高，LDH和ADH活性較低；隨淹澇時(shí)間延長，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，SDH活性逐漸下降，在96～120 h出現(xiàn)最高峰值，LDH和ADH活性會(huì)逐步上升，均在72 h出現(xiàn)最高峰值；當(dāng)淹澇時(shí)間超過120 h后，三種酶活性均下降至很小。這一變化趨勢與前人在其他植物的結(jié)論既有相似[17-19]，又有不同[20-23]，可能與植物種類、淹澇生育時(shí)期、淹澇程度等差異有關(guān)。

根據(jù)SDH、LDH和ADH之間的相互作用，可以推測出這樣一種關(guān)系[24-27]：在淹澇初期，由于植物體內(nèi)還有氧氣留存，三羧酸循環(huán)在短期內(nèi)還可以維持將丙酮酸完全氧化的狀態(tài)，所以此時(shí)的有氧呼吸大于無氧呼吸，SDH活性較高，而LDH和ADH的活性維持較低水平；在淹澇中期，植物體內(nèi)留存的氧氣已基本上被消耗完，植物為了維持代謝生長，無氧呼吸逐漸取代有氧呼吸，SDH活性逐漸降低，LDH和ADH活性上升。但是由于無氧呼吸同樣會(huì)產(chǎn)生丙酮酸，所以當(dāng)有丙酮酸產(chǎn)生時(shí)，三羧酸循環(huán)的運(yùn)行水平高，SDH活性高，當(dāng)丙酮酸含量低時(shí)，三羧酸循環(huán)運(yùn)行水平低，SDH活性低，但是由于長時(shí)間的無氧呼吸使得植物體內(nèi)的乳酸和乙醇不斷積累，影響到植株的整體生活力，所以SDH的起伏峰值隨著時(shí)間的延長一個(gè)比一個(gè)低；在淹澇后期，植株的整體生活力下降，大量的乳酸和乙醇積累使得無氧呼吸逐漸不能維持，此時(shí)SDH活性下降，LDH和ADH活性也下降。

致謝：感謝湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理與分子生物學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室屠乃美教授、李海林老師、劉紅梅老師、周雙鵬與孫媛同學(xué)在分析測試工作中給予的指點(diǎn)和幫助。